鄧輝

(武漢生物工程學院生命科學與技術(shù)學院 湖北武漢 430415)

巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)是一種單細胞真核生物,其表達系統(tǒng)是近些年發(fā)展起來的一種真核表達系統(tǒng),它與釀酒酵母有著很多相同的遺傳學和生物學特性。優(yōu)點概括為三點:高穩(wěn)定、高表達、高分泌。相對其它酵母來說更加易于操作。畢赤酵母相對其它酵母更易于分泌外源蛋白,而且外源基因整合非常穩(wěn)定,發(fā)酵工藝相對成熟,宿主細胞生長迅速。畢赤酵母能夠進行高密度的發(fā)酵,有著很強的誘導啟動子。不僅如此,畢赤酵母重組產(chǎn)物的生物活性比較高,其表達水平是其它酵母的10～100倍。表達可以到達75%。正是由于表達水平高,所以作為外源蛋白表達系統(tǒng)的畢赤酵母才會被廣泛運用于商業(yè)化生產(chǎn)外源蛋白。其中25%的影響主要分為以下七點:(1)啟動子的影響。(2)外源基因的自身影響。(3)外源基因拷貝數(shù)的影響。(4)遺傳背景的影響。(5)蛋白質(zhì)分泌的影響。(6)發(fā)酵條件的細微影響。(7)外源蛋白的加工修飾。

1 外源基因的選擇

外源基因自身的特性主要包括三個方面:(1)mRNA5’端非翻譯區(qū)(5’-2UTR)。(2)基因的A+T組成。(3)密碼子使用頻率。由于乙醇氧化酶在畢赤酵母(P.pastoris)中的表達程度極高(約占胞內(nèi)可溶性蛋白的30%)所以外源基因mRNA5’－UTR只有盡可能和AOXl mRNA5’－UTR保持一致,這樣才會有相對較高的蛋白表達率。由于終止密碼子的A+T含量豐富,所以在A+T豐富區(qū)可能會存在轉(zhuǎn)錄提前終止的密碼子,基因在巴斯德畢赤酵母中表達時偶爾會造成轉(zhuǎn)錄活動提前終止的主要原因正是因為基因中A+T含量相對較高。因此改變這一現(xiàn)象的方法就是對A+T含量豐富的基因重新進行序列設(shè)計,使其A+T含量盡可能保持在30%～55%范圍之內(nèi),盡可能避開終止密碼子。

2 表達載體的優(yōu)化

(1)強啟動子的選擇;啟動子在轉(zhuǎn)錄時為了表達調(diào)控基因,一般會選擇Aoxl啟動子。因為甲醇誘導性很強,外源基因可以在其中得到更高程度的表達。使用其它啟動子所到達的表達效率則大大低于Aoxl啟動子。PGAG(三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子)是最近在(P.pastoris)畢赤酵母中復制出來的一個組成型啟動子,該組成型啟動子不需要甲醇進行誘導,所以其發(fā)酵工藝相對更加簡單。所以在不久的將來,它是否會成為了代替PAOX1最強的啟動子,人類對此還有待研究。(2)信號肽的選擇;分泌表達不僅可以減輕宿主細胞代謝負荷,還可以減少宿主細胞內(nèi)部的蛋白酶對外源蛋白的降解.分泌表達是如今最理想的蛋白質(zhì)表達方式。迄今為止,人類的血清蛋白和牛凝血酶均是利用外源蛋白自身產(chǎn)生的信號肽與酵母信號肽表達外源蛋白的成功典例。如果外源蛋白自身產(chǎn)生的信號肽的序列表達效果不佳,可以嘗試甲醇酵母的信號肽。

3 外源基因的整合拷貝數(shù)增加

為了可以有效地獲得高產(chǎn)量,巴氏畢赤酵母載體在宿主染色體上大多數(shù)為單拷貝整合。由于PAoxl在甲醇誘導下整合后穩(wěn)定,所以即使單拷貝體也可以獲得高產(chǎn)量。目前有效提高外源基因整合拷貝數(shù)的方法主要有以下三種:(1)巴氏畢赤酵母的轉(zhuǎn)換方法主要是原生質(zhì)體法、電擊法、氯化鋰法等。最近在質(zhì)粒pPIC9K上發(fā)現(xiàn)帶有G418的抗性基因,這種抗性基因可以利用轉(zhuǎn)化子對G418抗性水平快速篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子。(配合電擊法效果最佳)(2)在體外載體上多次插入目的基因的片段。但是這種方法拷貝整合不穩(wěn)定,而且數(shù)量有限,所以并不常用。(3)將來自宿主或其它非必需高重復的基因片段與載體中目的基因的兩端連接,通過同源重組的方式從而達到高拷貝整合的目的。

4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

4.1 影響表達最為重要的因素就是通氣量

之前大多數(shù)會采用普通搖瓶進行發(fā)酵,由于普通搖瓶發(fā)酵的通氣效果不理想,會影響到菌體的高密度生長及表達。所以現(xiàn)在一般情況下會用發(fā)酵罐進行培養(yǎng),外源蛋白在發(fā)酵罐中的表達水平會比在普通搖瓶中發(fā)酵量高出10～100倍.從前大部分報道的結(jié)果都是在搖瓶發(fā)酵條件下產(chǎn)生的。所以推測,如果采用發(fā)酵罐進行發(fā)酵,其表達水平還將會有很大的提升空間。

4.2 影響高水平表達的重要因素之二——碳源

畢赤酵母表達培養(yǎng)基常用的碳源是甘油,但有些情況會用山梨糖醇代替甘油來作為碳源。雖然使用山梨糖醇得到的生物質(zhì)量下降,但外源蛋白的表達程度卻得到了大大的提高。相對甘油對AOX啟動子具有抑制作用的影響,結(jié)果上來看,使用山梨糖醇作為碳源表達程度上相比甘油大得多。

4.3 培養(yǎng)基組成

可用于培養(yǎng)P.Pastoris的培養(yǎng)基迄今為止主要有BMGY和FBS兩種。但因為BMGY含有磷酸緩沖液還有蛋白胨和酵母提取物,這幾種物質(zhì)可以使菌株生長更好,從而大大增加了生物量,產(chǎn)量也得到了很大程度的提高。

4.4 使用甲醇進行誘導的時間、用量、誘導方式

誘導的方式:(1)兩步法,首先用甘油培養(yǎng)細胞使其達到一定的濃度,再加入一定量的甲醇進行誘導。(2)聯(lián)合生長培養(yǎng)的方法,在早期加入甲醇誘導來誘導外源蛋白的表達。如果使用兩步法來誘導外源蛋白的表達,為了使得畢赤酵母能夠高效表達重組蛋白,關(guān)鍵要素就是誘導時的起始pH值。如果改變誘導時的pH值,外源蛋白表達量可以提高至少50%。使用growth-associated誘導甲醇酵母高水平表達外源基因,會比一般方法產(chǎn)生的結(jié)果高出近10倍。

5 結(jié)語

綜上所述,盡管畢赤酵母自身還存在許多缺點和不足,如在某些情況下會出現(xiàn)表達量低和無效分泌等。但不可否認畢赤酵母表達系統(tǒng)是外源蛋白高效表達的最佳載體,正因為如此,還有很多內(nèi)容值得我們?nèi)パ芯亢吞剿?相信隨著進一步的深入研究探索,不斷地積累經(jīng)驗和改良表達系統(tǒng),會有越來越多的外源基因在畢赤酵母系統(tǒng)中成功高效表達。畢赤酵母在生物制藥領(lǐng)域?qū)l(fā)揮越來越重要的作用。