馬瑩瑩,張 育，許金鑫，王燕茹

0 引言

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是以滑膜增生和進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞為特征的慢性炎癥性自身免疫性疾病，可導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞[1-2]。在RA，成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLS)通過許多信號(hào)通路對(duì)IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17、IL-18、IL-21、IL-27、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)等促炎因子產(chǎn)生炎癥應(yīng)答，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞因子和炎癥趨化因子以及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達(dá)導(dǎo)致組織損傷[1]，這些細(xì)胞因子在滑膜細(xì)胞增殖和關(guān)節(jié)血管翳形成中發(fā)揮主要作用[2]。除了促炎細(xì)胞因子和炎癥趨化因子外，許多抗炎因子也與RA的發(fā)病相關(guān)[3]。

近年來的研究表明，金雀異黃素(Genistein，gen)具有抗癌、抗氧化、抗炎等生物學(xué)功能，不僅在分子水平可以抑制酪氨酸特異性蛋白激酶，并且在細(xì)胞水平可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，抑制破骨細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的功能，發(fā)揮抗氧化效應(yīng)[4-5]。我們的前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Gen可以抑制CIA大鼠滑膜細(xì)胞IL-1β、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)[6-7]。為進(jìn)一步探討Gen對(duì)RA的治療作用，本實(shí)驗(yàn)觀察了Gen對(duì)CIA大鼠分泌的促炎和抗炎因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 金雀異黃素純品(純度≥99%)購自上海融合醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。按實(shí)驗(yàn)要求配成50 μm Gen治療組、100 μm Gen治療組、200 μm Gen治療組。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性近交系SD大鼠，清潔級(jí)，5～6周齡，平均體重(170±20)g，購于南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(蘇)2007-0001。

1.3 試劑 Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑購自Sigma公司；LT-α兔抗大鼠多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；IL-4、IL-6、IL-10兔抗大鼠單克隆抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；IL-8兔抗大鼠單克隆抗體購自英國Abcam公司；TGF-β1兔抗大鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；單組分四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液購于北京索萊寶科技有限公司。

1.4 儀器 酶標(biāo)儀MK3(ELX800)(BIO-TEK公司)、臺(tái)式離心機(jī)(TDL-5-A)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、電熱恒溫水浴箱(DKB-8A)(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、BMJ-III型包埋機(jī)(常州中威電子儀器廠)、石蠟切片機(jī)(RM2145)(LEICA)、玻片漂烘儀(PHY988)(常州中威電子儀器廠)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 動(dòng)物模型的建立 60只雌性SD大鼠隨機(jī)抽樣分成2組，分別為編號(hào)1～10為空白對(duì)照組，剩余50只為造模組。大鼠在清潔級(jí)環(huán)境中適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，建立CIA大鼠模型。模型組SD大鼠的左后足跖皮內(nèi)注射1mLⅡ型膠原乳劑，1周后以每只0.1 mL劑量尾根部皮內(nèi)多點(diǎn)激發(fā)注射加強(qiáng)免疫。空白對(duì)照組以生理鹽水注射，方法同模型組。

1.5.2 動(dòng)物模型的評(píng)價(jià) AI評(píng)分和關(guān)節(jié)腫脹度測定：按常規(guī)方法進(jìn)行評(píng)估[7]。

1.5.3 大鼠用藥及分組 造模組50只大鼠造模后以SPSS 16.0軟件隨機(jī)抽樣分為5組，分別為：模型對(duì)照組、50 μm Gen治療組、100 μm Gen治療組、200 μm Gen治療組和MTX陽性對(duì)照組。于造模次日開始用藥，各Gen治療組每天胃內(nèi)灌注Gen混懸液1 mL；MTX陽性對(duì)照組于造模后開始用藥，每周胃內(nèi)灌注1次MTX 1 mL，濃度為0.1 mg/mL；而空白組和模型對(duì)照組每天灌注等量的生理鹽水。

1.5.4 關(guān)節(jié)滑膜病理檢測 治療后第5周用3%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉各組大鼠，取膝關(guān)節(jié)置入10%甲醛溶液中固定48 h。常規(guī)制片染色，顯微鏡下觀察病理形態(tài)并拍照。

1.5.5 間接ELISA法檢測Gen對(duì)CIA大鼠血清中細(xì)胞因子分泌的影響 用方陣滴定試驗(yàn)確定一抗和二抗最佳稀釋濃度；用包被緩沖液把血清稀釋5倍后加入酶標(biāo)板中放4 ℃冰箱過夜，次日用PBST洗板3次后加入3%BSA封閉2 h，隨后洗板加入稀釋好的一抗放孵箱1 h，再次洗板3次后加用酶標(biāo)二抗37 ℃孵育1 h，洗板后每孔加入單組分TMB顯色液100 μL，37 ℃避光顯色10～20 min后加入終止液終止顯色，用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長時(shí)各孔的吸光值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理在SPSS 16.0及Excel 2003軟件中完成，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AI評(píng)分 見表1。

2.2 足肢腫脹程度 見圖1。

圖1 CIA大鼠足爪腫脹度

注：與對(duì)照組比較，△P<0.05；與模型組比較，★P<0.05；與50 μm Gen組比較，#P<0.05；與100 μm Gen組比較，▲P<0.05；與200 μm Gen組比較，▼P<0.05；與MTX組比較，■P<0.05

2.3 滑膜病理檢測 模型對(duì)照組大鼠滑膜明顯增厚，有大量炎性細(xì)胞浸潤和纖維組織增生；而空白對(duì)照組滑膜未見上述癥狀。見圖2。

圖2 滑膜組織的病理圖片(HE×200)

從CIA大鼠的AI評(píng)分、足肢腫脹度測定及關(guān)節(jié)滑膜病檢測顯示，CIA大鼠造模獲得了成功。

2.4 間接ELISA法檢測大鼠血清細(xì)胞因子表達(dá)

2.4.1 Gen對(duì)CIA大鼠血清中促炎因子LT-α、IL-6和IL-8表達(dá)的影響 模型對(duì)照組大鼠血清中IL-6、IL-8、LT-α的分泌明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)，Gen治療組和MTX陽性對(duì)照組與模型對(duì)照組相比，上述細(xì)胞因子的表達(dá)均明顯降低。Gen對(duì)IL-6和IL-8的抑制作用呈劑量依賴性，隨劑量增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)。50 μm Gen組對(duì)IL-6的抑制作用弱于MTX(0.1 mg/mL)組，而100 μm Gen組、200 μm Gen組對(duì)IL-6的抑制作用與MTX組相當(dāng)。50 μm Gen組和100 μm Gen組對(duì)IL-8的抑制作用弱于MTX(0.1 mg/mL)組，200 μm Gen組對(duì)IL-8的抑制作用與MTX組相當(dāng)。三種劑量Gen組對(duì)LT-α的抑制作用相當(dāng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)LT-α的抑制作用均弱于MTX陽性對(duì)照組。見圖3～圖5。

圖3 各組大鼠LT-α水平的比較

圖4 各組大鼠IL-6水平的比較

圖5 各組大鼠IL-8水平的比較

2.4.2 Gen對(duì)CIA大鼠血清中抗炎因子IL-4、IL-10和TGF-β1表達(dá)的影響 模型組大鼠血清中的細(xì)胞因子IL-4、IL-10、TGF-β1的表達(dá)水平低于空白對(duì)照組(P<0.05)，Gen和MTX均能上調(diào)上述因子的表達(dá)；Gen的上調(diào)作用呈劑量依賴性，隨劑量增加，促進(jìn)作用增強(qiáng)。50 μM Gen組對(duì)IL-4的誘導(dǎo)作用弱于MTX，100 μm Gen組對(duì)IL-4的抑制作用與MTX相當(dāng)，200 μm Gen組與MTX組對(duì)IL-4的誘導(dǎo)作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。50 μm Gen組、100 μm Gen組對(duì)IL-10的促進(jìn)作用低于MTX組，而200 μm Gen組對(duì)IL-10的上調(diào)作用與MTX陽性對(duì)照組作用相當(dāng)。三種劑量Gen治療組與MTX組對(duì)TGF-β1的誘導(dǎo)作用均存在差異，50 μm Gen組、100 μm Gen組的Gen對(duì)TGF-β1的誘導(dǎo)作用均弱于MTX組，而200 μm Gen組對(duì)TGF-β1的誘導(dǎo)作用比MTX組強(qiáng)。見圖6～圖8。

圖6 各組大鼠IL-4水平的比較

圖7 各組大鼠IL-10水平的比較

圖8 各組大鼠TGF-β1水平的比較

3 討論

RA是以關(guān)節(jié)滑膜組織慢性炎癥為特征的自身免疫性疾病，可引起軟骨破壞和骨侵蝕。CIA是一個(gè)被公認(rèn)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型[8]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Ⅱ型膠原構(gòu)建CIA大鼠模型，造模后出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹伴活動(dòng)受限，觀察AI評(píng)分、后肢容積以及關(guān)節(jié)滑膜組織病理發(fā)現(xiàn)，造模組與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示造模成功。

在RA中IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎因子在RA關(guān)節(jié)中高度表達(dá)，且在RA的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮主要作用。FLS經(jīng)上述促炎因子刺激后，可產(chǎn)生炎癥趨化因子、MMPs、前列腺素E2(PGE2)和環(huán)氧化酶-2(COX-2)，這些均進(jìn)一步促進(jìn)炎癥、滑膜增生和軟骨破壞[9]。LT-α又稱TNF-β，屬于TNF超家族，有研究發(fā)現(xiàn)，在RA FLS中LT-α可活化有絲分裂原相關(guān)蛋白激酶(MAPK)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)和P38，以及磷酸肌醇3激酶(PI3K/AKT)，這些信號(hào)通路可以促進(jìn)細(xì)胞增殖[1]。而且在CIA動(dòng)物模型中，用單克隆抗體阻斷LT-α后，病情明顯緩解，提示LT-α參與RA的病理過程。LT-α通過活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子IL-6、IL-8、MMP-3來產(chǎn)生作用。IL-6、IL-8可活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，而MMP-3在RA中直接導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞[1,10]。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，CIA模型組大鼠血清中IL-6、IL-8、LT-α的分泌明顯高于空白對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)了上述促炎因子參與RA的炎癥過程，在RA滑膜炎癥的發(fā)病機(jī)制中可能起著重要的作用。

在RA中FLS、白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌的促炎和抗炎因子的失調(diào)與關(guān)節(jié)炎癥和軟骨破壞有關(guān)[3]。許多研究表明，IL-4在RA發(fā)病過程中通過抑制細(xì)胞反應(yīng)和炎性細(xì)胞因子而起抗炎作用，IL-4還可抑制滑膜細(xì)胞的增殖，抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子的產(chǎn)生[11-12]。另外，IL-10可下調(diào)RA的炎癥應(yīng)答，IL-10通過抑制核因子κB而抑制TNF-α、IL-2、IFN-γ的產(chǎn)生，還可抑制Th1細(xì)胞介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞活性，抑制NO的合成和PGE2的產(chǎn)生[11]。TGF-β1是RA滑膜炎和滑膜增生的主要抑制因子，關(guān)節(jié)滑膜中TGF-β1的增加與關(guān)節(jié)炎的病理改變有關(guān)，可以抑制局部炎癥細(xì)胞核淋巴細(xì)胞的功能[13]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CIA模型組大鼠血清中IL-4、IL-10、TGF-β1的表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組，提示上述抗炎因子在RA的病理過程中，分泌減少，導(dǎo)致促炎因子和抗炎因子的失調(diào)，使得RA的炎癥病理過程進(jìn)一步發(fā)展。

Gen作為酪氨酸激酶抑制劑，可以有效抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的NF-κB的活化，在體外試驗(yàn)中可同時(shí)抑制NF-κB相關(guān)的細(xì)胞因子(IL-6、IL-8、TNF-α)的產(chǎn)生[5]。Gen在抑制脾細(xì)胞增生中發(fā)揮作用，可降低INF-γ的水平，刺激IL-4的分泌，且Gen在免疫調(diào)節(jié)中的作用在于保持Th1/Th2的平衡。本研究結(jié)果表明，Gen能下調(diào)促炎因子IL-6、IL-8、LT-α的分泌，200 μM Gen組對(duì)IL-6、IL-8的抑制作用與MTX相當(dāng)，而各Gen治療組對(duì)LT-α的抑制作用均弱于MTX；Gen能上調(diào)抗炎因子IL-4、IL-10、TGF-β1的分泌。100 μM Gen組對(duì)IL-4的上調(diào)作用與MTX相當(dāng)；200 μM Gen組對(duì)IL-10的上調(diào)作用與MTX相當(dāng)；200 μM Gen組對(duì)TGF-β1的上調(diào)作用強(qiáng)于MTX，提示Gen可能通過抑制RA炎癥因子的釋放，增加抗炎因子的表達(dá)來改善關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜炎癥。

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