吳 麗 李筠璐 王艷蕾

(河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河北唐山 063000)

腸缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是外科臨床實踐中常見的組織損傷之一，在嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克、心肺功能不全等疾患的病理過程中起重要作用。早在20世紀(jì)50年代Lillehei就提出小腸是休克向不可逆發(fā)展的樞紐器官。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK)為絲裂原活化蛋白激酶信號通路中三個主要的亞家族之一，是介導(dǎo)細(xì)胞因子及應(yīng)激刺激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、分化及炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［1］。大量文獻(xiàn)證實p38MAPK在缺血再灌注損傷中活化，并引起組織器官結(jié)構(gòu)和功能的變化。本文就p38MAPK信號通路在腸缺血再灌注損傷中的作用作一綜述。

1 p38MAPK的概述

1.1 p38MAPK的發(fā)現(xiàn)、分型與分布 p38MAPK于1993年由Brewster等［2］發(fā)現(xiàn)，是360個氨基酸殘基組成的38kD的蛋白質(zhì)。1994年Han等［3］用高滲和內(nèi)毒素刺激小鼠肝臟細(xì)胞，分離純化出分子量為38kD的酪氨酸磷酸化蛋白激酶—p38MAPKs，并從小鼠肝細(xì)胞cDNA文庫中篩選到編碼p38MAPK的基因。研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK 家族包括 p38α、p38β、p38γ、p38δ 4 種異構(gòu)體亞型，它們的分布具有組織特異性。p38α表達(dá)廣泛，在白細(xì)胞、肝、脾、小腦、骨髓、甲狀腺、胎盤中都有較高水平的表達(dá);p38β在腦和心臟中含量豐富;p38γ主要存在于骨骼肌;p38δ大量存在于肺、腎、腸、唾液腺的表皮細(xì)胞及睪丸、卵巢、垂體、腎上腺。

1.2 p38MAPK信號通路的激活 p38MAPK信號通路通過多級激酶的級聯(lián)反應(yīng)把細(xì)胞外信號向細(xì)胞內(nèi)傳遞，其中需要3個關(guān)鍵激酶:MAPK、MAPK激酶(MAPKK)、MAPKK激酶(MAPKKK)。細(xì)胞受到刺激后首先激活 MAPKKK，其下游激酶 MAPKK通過氨基末端的特定序列與活化的 MAPKKK結(jié)合后被激活，活化后與MAPKKK解聚，轉(zhuǎn)而結(jié)合 MAP使之活化，從而激活p38MAPK通路。p38MAPK信號通路的上游激活物是MKK3(即MAPKK3)、MKK4和MKK6，其中MKK4能同時激活JNK，而MKK3、MKK6 僅特異激活 p38MAPK［4］。除了 MAPKKK →MKK3/MKK6→p38MAPK級聯(lián)反應(yīng)路線外，還存在一條不依賴MKK機(jī)制的自身磷酸化途徑，p38α能夠在轉(zhuǎn)錄生長因子-β(TGF-β)激活的蛋白激酶1結(jié)合蛋白［TGF-β-activated protein kinase 1(TAK1)-binding protein;TAB1］的幫助下完成自身磷酸化過程。

1.3 p38MAPK信號通路激活后效應(yīng) 在各種應(yīng)激因素如紫外線、H2O2、熱休克和缺氧等、炎性因子(TNF-α、IL-l和TGF-β等)及LPS和革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁成分作用下，p38MAPK酪氨酸/蘇氨酸發(fā)生雙磷酸化而激活，活化的p38MAPK移位進(jìn)入細(xì)胞核，通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)效應(yīng)基因的表達(dá)。p38MAPK信號通路控制多種轉(zhuǎn)錄因子的激活，如磷酸化轉(zhuǎn)錄因子2(activated transcription factor-2，ATF-2)氨基端活化區(qū)域69與71位的蘇氨酸，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄活性升高，與靶基因順式元件結(jié)合，從而調(diào)節(jié)包括TNF-α、IL-1、IL-6和iNOs等多種炎性細(xì)胞因子的基因表達(dá)及蛋白合成;另一方面，TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等炎性細(xì)胞因子反過來又激活p38MAPK信號通路［5］，產(chǎn)生逐級放大的炎癥級聯(lián)反應(yīng)。激活的p38MAPK信號通路主要參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化與凋亡、炎癥反應(yīng)等病理生理過程［6］。

2 p38MAPK信號通路與腸缺血再灌注損傷

由于腸道代謝活躍、黏膜血管結(jié)構(gòu)呈發(fā)夾狀，使腸道成為內(nèi)臟中對I/R損傷最敏感的器官。腸缺血再灌注導(dǎo)致組織氧供需失衡，腸黏膜屏障受損，腸內(nèi)細(xì)菌毒素移位，激活單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，合成、釋放大量炎性細(xì)胞因子，引發(fā)腸道局部或全身性不可控制的炎癥反應(yīng)和促炎介質(zhì)的過度釋放，觸發(fā)全身炎癥反應(yīng)，甚至多器官功能衰竭(multisystem and organ failure，MSOF)。研究表明，氧化應(yīng)激、小腸黏膜屏障破壞致細(xì)菌內(nèi)毒素移位、炎性細(xì)胞因子的釋放、細(xì)胞凋亡等在腸I/R損傷中起著重要作用。而p38MAPK信號通路與這些機(jī)制都有或多或少的聯(lián)系。

2.1 p38MAPK與氧化應(yīng)激 氧化應(yīng)激是腸I/R損傷的一個主要的損傷機(jī)制。I/R時小腸缺血、缺氧，細(xì)胞內(nèi)大量ATP經(jīng)腺苷轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤，再灌注后，氧供增加，次黃嘌呤氧化為黃嘌呤，富含黃嘌呤氧化酶的腸上皮細(xì)胞將黃嘌呤氧化，產(chǎn)生大量氧自由基;而腸組織中含有豐富的不飽和脂肪酸，最易發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而破壞腸黏膜細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致線粒體腫脹，鈉鉀泵失靈，細(xì)胞內(nèi)鈉水潴留，進(jìn)而引發(fā)腸黏膜屏障功能損害及通透性增加［7］。p38MAPK信號通路是調(diào)控機(jī)體應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的重要通路。研究發(fā)現(xiàn)，氧自由基參與p38MAPK的活化。劉文軍等［8］觀察腎I/R早期以及應(yīng)用自由基清除劑tempol清除ROS后p38MAPK活化情況，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注早期p38MAPK很快被誘導(dǎo)活化，45min達(dá)到峰值，給予ROS清除劑可以明顯抑制p38MAPK的活化，表明p38MAPK信號通路的激活與氧自由基產(chǎn)生有關(guān)。盡管大量研究證實活性氧，如過氧化氫等，能激活p38MAPK，但其確切機(jī)制尚不完全清楚［9］。

2.2 p38MAPK與腸黏膜屏障功能 腸黏膜屏障是機(jī)體防御腸道有害刺激的第一道防線，在維持腸黏膜完整性、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等方面有重要作用。腸I/R可引起腸道缺血、缺氧性損害，導(dǎo)致腸黏膜屏障破壞，引起細(xì)菌和內(nèi)毒素移位，誘導(dǎo)全身過度、失控、自毀的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征，甚至多器官功能衰竭。腸黏膜屏障主要包括腸道機(jī)械屏障和免疫屏障兩部分。腸黏膜屏障的破壞是發(fā)生細(xì)菌移位、腸源性感染的重要原因［10］。腸I/R時，各種損傷因素可通過細(xì)胞膜受體介導(dǎo)，激活p38MAPK信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK激活時間及程度與缺血再灌注腸損傷時間、程度一致。再灌注后6h，可見腸絨毛大量脫落，炎細(xì)胞浸潤，腸道組織結(jié)構(gòu)破壞。Zheng等［11］在Wistar大鼠腸I/R實驗中發(fā)現(xiàn)，再灌注30 min小腸組織p38MAPK即達(dá)活化高峰，p38MAPK活化促進(jìn)腸上皮細(xì)胞凋亡，破壞腸黏膜屏障功能。Waetzig等［12］報道了 MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的ERK1/ERK2、JNK/SAPK、p38MAPK參與炎癥性腸疾病(IBD)的腸黏膜損傷。在IBD導(dǎo)致腸黏膜上皮損傷過程中，p38 MAPK(α)、JNK和ERK1/ERK2均被激活，其中p38 MAPK(α)活性變化最明顯。Costantini等［13］發(fā)現(xiàn)Bal b/c小鼠全層皮膚30%造成嚴(yán)重?zé)齻芗せ钅c組織p38MAPK，緊密連結(jié)蛋白肌球蛋白輕鏈激酶 (myosin light chain kinase，MLCK)表達(dá)增加，導(dǎo)致腸屏障功能破壞，腸通透性增加，應(yīng)用SB203580抑制p38MAPK的活化明顯減輕嚴(yán)重?zé)齻鸬哪c黏膜屏障功能障礙。

2.3 p38MAPK與炎性細(xì)胞因子 腸I/R損傷后，由于缺血致腸道黏膜屏障功能喪失，使腸內(nèi)細(xì)菌、內(nèi)毒素移位至全身。血液循環(huán)中的內(nèi)毒素與脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)結(jié)合，再與單核/巨噬細(xì)胞表面的受體CD14分子結(jié)合形成復(fù)合物。復(fù)合物與TLR4受體富含亮氨酸重復(fù)序列(LRR)的胞外區(qū)結(jié)合，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號傳遞，激活單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子［14］。腸道是最早產(chǎn)生細(xì)胞因子的部位，活化的巨噬細(xì)胞是TNFα的主要來源，大量的巨噬細(xì)胞存在于小腸黏膜固有層，因此，小腸有產(chǎn)生TNFα的巨大潛力。TNFα能激活中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞，釋放大量介質(zhì)如氧自由基、蛋白酶等，介導(dǎo)小腸組織細(xì)胞損傷;它還可誘導(dǎo)IL-1、IL-6、IL-8等其他細(xì)胞因子的瀑布樣釋放。細(xì)胞因子是一個“大家族”，由復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)所調(diào)節(jié)。一旦一種細(xì)胞因子產(chǎn)生，就能促進(jìn)它自身和其他細(xì)胞因子的生成，并形成級聯(lián)和擴(kuò)展。p38MAPK通過磷酸化被激活后，可進(jìn)入細(xì)胞核，通過磷酸化而激活多種轉(zhuǎn)錄因子，對多種靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，其中包括IL-6、IL-1、TNFα等促炎性細(xì)胞因子。所以，在調(diào)控細(xì)胞因子產(chǎn)生的機(jī)制中，p38MAPK起著類似“開關(guān)”的作用，如果抑制該信號通路，可能就會抑制促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而緩解炎癥過程。Aqrawal等［15］研究發(fā)現(xiàn)刺激人外周血B細(xì)胞后，可致細(xì)胞內(nèi)p38MAPK激活，抑制這一過程可減輕甚至完全阻斷細(xì)胞內(nèi)TNFα等炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，說明炎癥反應(yīng)中TNFα等炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生與p38MAPK激活密切相關(guān)。實驗證實p38MAPK活化后不僅可增強(qiáng)TNF-α等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，而且不斷增加的炎性細(xì)胞因子又通過正反饋，進(jìn)一步促進(jìn)p38MAPK的活化和表達(dá)，從而誘導(dǎo)各種凋亡調(diào)控因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致組織細(xì)胞的凋亡和壞死，加重組織損傷［16］。

2.4 p38MAPK與細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡(apoptosis)，又稱程序性細(xì)胞死亡，是一種由基因調(diào)控的細(xì)胞主動而有序死亡的過程，是近幾年生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。目前認(rèn)為，細(xì)胞凋亡與臨床上許多疾病的病理機(jī)制密切相關(guān)。它不僅在自身免疫疾病、腫瘤、衰老等病理現(xiàn)象中起著重要的作用，而且在器官移植領(lǐng)域的缺血/再灌注損傷中也起到十分重要的作用，細(xì)胞凋亡是臟器、組織在缺血/再灌注期間的一種普遍現(xiàn)象。腸I/R不僅造成腸道組織的壞死，還可通過多種途徑引起腸道局部組織和遠(yuǎn)隔器官的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡性改變［17］。適度的細(xì)胞凋亡是維持機(jī)體細(xì)胞適量穩(wěn)定的重要機(jī)制，而凋亡過度則會造成機(jī)體損傷。大量研究表明，p38MAPK信號通路在多種應(yīng)激刺激條件下激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻斷p38MAPK級聯(lián)不僅能減輕炎癥反應(yīng)，還可減輕缺血再灌注損傷［18］。實驗證實應(yīng)用SB203580特異性抑制p38MAPK的活性，無論在體外還是體內(nèi)都有很強(qiáng)的抗凋亡的作用，能阻斷p38MAPK對下游基因的調(diào)控，減少凋亡調(diào)控因子的產(chǎn)生［19］。劉永芳等［20］研究發(fā)現(xiàn)，小腸I/R后造成p38MAPK通路的大量激活，誘導(dǎo)凋亡調(diào)控因子表達(dá)上調(diào)，從而使小腸組織細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡的趨勢;給予p38MAPK途徑抑制劑后，能顯著減輕小腸組織細(xì)胞的凋亡。目前認(rèn)為，p38MAPK主要通過以下途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡:①增強(qiáng)c-myc表達(dá);②磷酸化p53;③參與Fas/Fasl介導(dǎo)的凋亡;④激活c-jun和c-fos;⑤誘導(dǎo)Bax轉(zhuǎn)位;⑥增強(qiáng)TNF表達(dá)而誘導(dǎo)凋亡。

［1］Sigala I，Zacharatos P，Toumpanakis D，et al.MAPKs and NF- κB differentially regulate cytokine expression in the diaphragm in response to resistive breathing:the role of oxidative stress［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2011，300(5):R1152

［2］Brewster JL，De Valoir T，Dwyer ND，et al.An osmosensing signal transduction pathway in yeast［J］.Science，1993，259(5102):1760

［3］Han J，Lee JD，Bibbs L，et al.A MAP kinase targeted by endotoxin and hyperosmolarity in mammalian cells［J］.Science，1994，265(5173):808

［4］Zarubin T，Han J.Activation and signaling of the p38 MAP kinase pathway［J］.Cell Res，2005，15(1):11

［5］Stjernberg-Salmela S，Ranki A，Karenko L，et al.Low TNF-induced NF-kappaB and p38 phosphorylation levels in leucocytes in tumour necrosis factor receptor-associated periodic syndrome［J］.Rheumatology，2010，49(2):382

［6］Cuenda A，Rousseau S.p38 MAP-kinases pathway regulation，function and role in human diseases［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1773(8):1358

［7］張 華，陳聰?shù)?，李仲榮，等.兔腸缺血/再灌注損傷的超微結(jié)構(gòu)改變及紅花的保護(hù)作用［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2009，25(4):472

［8］劉文軍，賈一韜，夏照帆，等.大鼠腎缺血再灌注損傷后p38絲裂原活化蛋白激酶的活化及氧自由基清除劑對其影響［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2008，29(2):167

［9］Son Y，Kim S，Chung HT，et al.Reactive Oxygen Species in the Activation of MAP Kinases［J］.Methods Enzymol，2013，528:27

［10］Saito T，Unno N，Yamamoto N，et al.Intraperitoneal administration of hyperbarically oxygenated perfluorochemical enhances preservation of intestinal mucosa against ischemia/reperfusion injury［J］.Shock，2006，26(6):620

［11］Zheng SY，F(xiàn)u XB，Xu JG，et al.Inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase may decrease intestinal epithelial cell apoptosis and improve intestinal epithelial barrier function after ischemia-reperfusion injury［J］.World J Gastroenterol，2005，11(5):656

［12］Waetzig GH，Seegert D，Rosenstiel P，et al.p38 mitogen activated protein kinase is activated and linked to TNF alpha signaling in inflammatory bowel disease［J］.J Immunol，2002，168(10):5342

［13］Costantini TW，Peterson CY，KrollL，et al.Role of P38MAPK in burninduced intestinal barrier breakdown［J］.J Surg Res，2009，156(1):64

［14］Hommes DW，Peppelenbosch MP，van Deventer SJ.Mitogen activated protein(MAP)kinase signal transduction pathways and novel antiinflammatory targets［J］.Gut，2003，52(1):144

［15］Aqrawal S，Gollapudi S，Su H，et al.Leptin activates human B cells to secrete TNF- α，IL-6，and IL-10 via JAK2/STAT3 and p38MAPK/ERK1/2 signaling pathway［J］.J Clin Immunol，2011，31(3):472

［16］Yamaquchi K，Kawahara T，Kumakura S，et al.Effect of olprinone，a phosphodiesterase III inhibitor，on hepatic ischemia-reperfusion injury in rats［J］.Shock，2010，33(4):436

［17］Varga J，Stasko P，Tóth S，et al.Morphological and apoptotic changes in the intestinal mucosa and lung parenchyma after ischaemic/reperfusion injury of the jejunum［J］.Acta Vet Hung，2010，58(2):243

［18］Mukhopadhyay P，Rajesh M，Horváth B，et al.Cannabidiol protects against hepatic ischemia/reperfusion injury by attenuating inflammatory signaling and response，oxidative/nutritive stress，and cell death［J］.Free Radic Biol Med，2011，50(10):1368

［19］Lim S J，L ee YJ，Lee E.p38MAPK in hibitor SB203580 sensitizes human SNU-C4 colon cancer cells to exisulind-induced apoptosis［J］.Oncology Reports，2006，16(5):1131

［20］劉永芳，劉志剛，秦 丹，等.SB203580對腸缺血再灌注大鼠p38MAPK及細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國誤診學(xué)雜志，2010，10(12):2778