趙艷麗，董宏偉,2，陳小慶，姜 雪，劉秋艷，胡桂學(xué)*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林省農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130021)

貓杯狀病毒(Feline calicivirus，F(xiàn)CV)是杯狀病毒科(Calicivirdae)水瘡性病毒屬(Vesivirus)的成員之一[1]，其基因組為單股正鏈RNA，無(wú)囊膜，核衣殼呈二十面體對(duì)稱。FCV 可引起貓多發(fā)性口腔和呼吸道傳染病，還可引起結(jié)膜炎，因此又稱為貓傳染性鼻-結(jié)膜炎病毒。自1957 年Fastier 首次分離鑒定FCV 以來(lái)，在歐洲、美洲、亞洲均有FCV 的報(bào)道，目前已呈世界性分布。幾乎所有的貓科動(dòng)物，如貓、虎[2]、獅[3]和獵豹[4]等對(duì)FCV 均易感，一歲以下的貓最易感，也有狗感染的報(bào)道[5]。FCV 感染貓通常局限于口腔和上呼吸道。有些病毒株可以引起慢性胃腸炎和急性關(guān)節(jié)炎[6]。FCV 感染與慢性口腔炎有密切的關(guān)系，多數(shù)感染的貓可以向外界排毒[7]。FCV 在貓群中高度流行，主要是因?yàn)樵S多的臨床康復(fù)貓仍然是持續(xù)的病毒攜帶者。該病發(fā)病率較高，死亡率較低。近年來(lái)FCV 強(qiáng)毒變異株感染不斷暴發(fā)，甚至發(fā)生在疫苗免疫貓中[8]，不僅會(huì)引起口腔、皮膚潰瘍，還會(huì)導(dǎo)致肝、脾和胰臟的損傷，貓死亡率增加。FCV 變異株還可以引起貓的嚴(yán)重急性致命的全身性疾病(Virulent systemic disease，VSD)。

由于商品疫苗的使用，野毒株與活疫苗株F9 間的交叉保護(hù)反應(yīng)逐漸變?nèi)?，疫苗免疫失敗現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。現(xiàn)有的疫苗雖然能夠減少臨床癥狀和病毒的排出，但可能無(wú)法防止感染。強(qiáng)毒株引起的暴發(fā)和疫苗免疫失敗與FCV 的基因及其抗原多樣性密切相關(guān)。

1 病毒基因多樣性

1.1 病毒基因組結(jié)構(gòu) FCV 通常被認(rèn)為只有一個(gè)基因組[9]，不過(guò)日本學(xué)者研究證明兩個(gè)分離基因組的存在[10]。在病毒感染的細(xì)胞中，除基因組RNA 外還存在著亞基因組RNA，基因組RNA 為7 600 nt，亞基因組RNA 為2 400 nt，二者5'端均連接著15 ku 的VPg 蛋白，VPg 蛋白取代了5'端的帽狀結(jié)構(gòu)，直接與蛋白翻譯起始因子作用，啟動(dòng)病毒的翻譯過(guò)程[11]。二者3' 端均連接著poly(A)，正鏈RNA病毒poly(A)尾巴與病毒復(fù)制及侵染性有密切聯(lián)系[12]。病毒基因組RNA 包含3 個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)，分別為ORF1、ORF2、ORF3。ORF1 編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，包括一個(gè)病毒蛋白酶和RNA 依賴的RNA 多聚酶。ORF2 編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1，共有A-F 6 個(gè)區(qū)。A 區(qū)有一段FCV 共有序列，高度保守，A 區(qū)在衣殼蛋白VP1 成熟過(guò)程中被裂解掉；B區(qū)含有潛在的肉豆蔻化甘氨酸和ATP/GTP 結(jié)合位點(diǎn)，組成病毒的核心結(jié)構(gòu)；C 區(qū)為可變區(qū)；D 區(qū)為高度保守區(qū)；E 區(qū)含有FCV 的抗原表位，含有主要B 細(xì)胞表位，可作為毒株分型的參照；E 區(qū)被28 個(gè)保守堿基(ConE)分成5'端和3' 端高變區(qū)(HRV)[13]，有人認(rèn)為FCV 不同毒株之間發(fā)生交叉反應(yīng)以及FCV 只具有單一血清型均與ConE 有關(guān)；F 區(qū)在衣殼蛋白的羧基端，高度保守，位于病毒的表面，是非中和單克隆抗體(MAbs)的連接位點(diǎn)。FCV 成熟的衣殼蛋白也能夠自我組裝成空衣殼即病毒樣粒子(VLPs)，但不具有感染性[14]。ORF3 位于基因組的3' 末端，編碼大小約為12 ku 的結(jié)構(gòu)蛋白VP2。病毒亞基因組包含ORF2 和ORF3，病毒可能利用亞基因組RNA 進(jìn)行基因表達(dá)。

1.2 病毒基因組多樣性 FCV 屬于RNA 病毒，與DNA復(fù)制基因信息相對(duì)精確相比，RNA 通常是不精確的，基因組具有高度適應(yīng)性，在選擇壓力的作用下表現(xiàn)為進(jìn)化快速。像許多其他的RNA 病毒一樣，F(xiàn)CV 有能力發(fā)展核心的生存策略，主要體現(xiàn)在基因組的多樣性上[15]。

FCV 病毒株間的基因變異型已被用于疾病暴發(fā)的流行病學(xué)調(diào)查。一些研究顯示FCV 不同病毒株在衣殼變異區(qū)存在20 %～40 %的差異，而共享現(xiàn)在流行病學(xué)鏈的分離株，在該區(qū)的變異一般在6 %以下，很可能代表相同株的變異[16]。

澳大利亞FCV 分離株的衣殼蛋白與經(jīng)典病毒株F9 的不同，其預(yù)測(cè)氨基酸序列的變化為整個(gè)衣殼蛋白的11 %～17.5 %，最明顯的差異出現(xiàn)在HRV C 和E，HRV E 的變異為22 %～34 %。澳大利亞株對(duì)F9 株MAbs 缺乏反應(yīng)性，這與其E 區(qū)結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸改變有關(guān)[17]。vsFCV 株(FCV-33585)衣殼蛋白的HRV 基因序列與114 個(gè)已知序列比較分析顯示vsFCV 株潛在的唯一特征是2 個(gè)氨基酸的變化[18]。首次分離于中國(guó)廣東的FCV CH-GD 株的全基因序列與各參考株的同源性僅為75.4 %～77.1 %，明顯低于各參考株之間的同源性78.9 %～99.9 %，而且CH-GD株有3 個(gè)區(qū)域的3 個(gè)連續(xù)的氨基酸發(fā)生了變異，3 個(gè)區(qū)域的抗原性和親水性也發(fā)生了相應(yīng)的變化[19]。分離自巴西南部南里奧格蘭德的13 個(gè)FCV 株與F9 株比較，其ORF2(B-F)預(yù)測(cè)氨基酸序列的主要變異出現(xiàn)在C 區(qū)和HRV E，D 區(qū)、HRV E 5' 端、Con E 的抗原表位也出現(xiàn)一些變化，核苷酸距離值存在0.8 %～50.1 %的差異。這是首次對(duì)FCV 巴西分離株的序列分析及對(duì)其系統(tǒng)發(fā)育間關(guān)系的描述[20]。Radford 等確定了FCV 在細(xì)胞培養(yǎng)物和持續(xù)感染貓中的序列進(jìn)化，并將其與病毒中和變化聯(lián)系起來(lái)[13]。隨后他們又鑒定了一個(gè)FCV 分離株衣殼基因HRV E 有一些輕微的變異，該病毒株與一個(gè)FCV 減毒活疫苗株密切相關(guān)，表明本地病毒已經(jīng)從疫苗病毒中進(jìn)化，而且持續(xù)存在[16]。Weeks 等對(duì)一株從佛羅里達(dá)州臨床健康的家貓口腔中分離的FCV 序列分析顯示其C、E、F 區(qū)序列與疫苗株F9 有顯著差異，其HRV E 比疫苗株F9 少3 個(gè)氨基酸，顯示當(dāng)前流行的FCV 株可能與疫苗株不一致[21]。此外，Schorr-Evans 等研究表明致命的FCV、流行的FCV 以及疫苗株FCV-F9 在遺傳和血清學(xué)上存在差異[8]。

由于抗FCV 疫苗的免疫失敗，在日本開(kāi)展了有關(guān)能夠引起疫苗免疫失敗的野毒株(Vaccine breakdown strains，VBS)基因及特性的相關(guān)研究。2007 年Ohe 等從接種商業(yè)FCV 疫 苗(F9、FCV-255、FC-7)的貓中分離出15 個(gè)FCV-VBS 株并檢測(cè)其基因組。進(jìn)化樹(shù)分析顯示8 個(gè)分離株(53 %)、疫苗株F9、FCV-255 屬于基因群I(G(A)I)，7個(gè)分離株(47 %)屬于基因群II(G(A)II)，從接種F9、FCV-255、FC-7 疫苗的貓中分別分離到的VBS 株依次為屬于G(A)II 的多于G(A)I、G(A)II 少于G(A)I、G(A)II 等于G(A)I，表明病毒分離株的基因群隨著疫苗株的使用而變化；貓抗F9 和兔抗FCV-255 血清對(duì)15 個(gè)分離株的中和滴度都非常低，表明中和抗體滴度和基因群沒(méi)有關(guān)系；病毒分離株和疫苗株的基因序列同源性低，為70.6 %～82.9 %，表明沒(méi)有病毒株序列來(lái)自疫苗株；氨基酸序列比對(duì)顯示從接種F9、FCV-255 疫苗的貓中分離的FCV-VBS株在F9 株衣殼蛋白區(qū)5' 端HRV 位置有些變化，推測(cè)這些變化可能影響基因群；從接種F9 疫苗的貓中分離到的FCV-VBS 株，G(A)I 和G(A)II 共有的F9 線性表位氨基酸的改變發(fā)生在分離株衣殼蛋白E 區(qū)5' HRV 450，451，457 位置，接種FCV-255 疫苗的發(fā)生在449，450，451 位置，這些氨基酸的改變參與逃逸，與疫苗免疫失敗有關(guān)，這些結(jié)果顯示交替使用F9 和FCV-255 疫苗或包含G(A)II株的多價(jià)疫苗能夠抑制病毒進(jìn)化或變異[22]。隨后他們研究認(rèn)為疫苗免疫失敗存在兩個(gè)機(jī)制：一個(gè)是與疫苗免疫水平有關(guān)，另一個(gè)是無(wú)關(guān)。FCV-VBS 的特點(diǎn)為：病毒感染前帶有抗體滴度高時(shí)，病毒持續(xù)排出的時(shí)間短；排出的病毒分子種類不斷變化，并不是隨著時(shí)間限制在一個(gè)特定的種類；病毒物理化學(xué)性質(zhì)持續(xù)改變，F(xiàn)CV-VBS 改變了分子物種和物理化學(xué)特性，歸因于宿主免疫壓力減少，可能導(dǎo)致VSD[23]。

也有學(xué)者對(duì)FCV 持續(xù)感染和多樣性的進(jìn)化機(jī)制進(jìn)行了探討。Pedersen 等認(rèn)為FCV 持續(xù)感染不能單一地通過(guò)VBS 株的出現(xiàn)來(lái)解釋，疫苗病毒本身可能有助于急性、慢性感染和疾病的發(fā)生[24]。Coyne 等利用分布在5 個(gè)不同地理位置上的家貓F(tuán)CV 的流行感染，通過(guò)測(cè)定其衣殼蛋白免疫主導(dǎo)區(qū)和可變區(qū)序列，確定了病毒利用的不同進(jìn)化過(guò)程對(duì)確保它長(zhǎng)期在宿主內(nèi)生存的相對(duì)貢獻(xiàn)。研究表明真正在個(gè)體中長(zhǎng)期持續(xù)的感染是比較罕見(jiàn)的，大多數(shù)病毒攜帶者經(jīng)歷病毒逐漸演變和循環(huán)感染，在個(gè)體水平逐漸演變和在個(gè)體和群體水平變異株再感染與積極選擇有關(guān)。逐漸演變和變異株再感染引導(dǎo)一個(gè)特定病毒株在個(gè)體和群體中的多樣性逐漸增加，直到新病毒株出現(xiàn)[25]。他們的最新研究表明在大多數(shù)情況下，空間和時(shí)間不同的病毒株在系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中混合，當(dāng)前的FCV 進(jìn)化與病毒株間的選擇競(jìng)爭(zhēng)無(wú)關(guān)。相反，伴隨許多病毒株的共同流行，這些變異可能通過(guò)從頭演變和從更廣泛的自然中偶爾的基因流動(dòng)在群體水平上存在，這種復(fù)雜性首次提供了判斷當(dāng)?shù)睾蛧?guó)家水平疫苗交叉保護(hù)的一個(gè)基準(zhǔn)[26]。

2 病毒抗原多樣性

由于FCV 基因組不同，F(xiàn)CV 抗原也呈現(xiàn)出多樣性，F(xiàn)CV 包含大量的病毒株，在病毒株之間有大量的抗原變異，大多數(shù)的病毒株被分為不同的抗原。這些抗原的不同已經(jīng)被用于開(kāi)發(fā)FCV 的分型方法[17]?？梢哉J(rèn)為所有的FCV 株都屬于一個(gè)抗原多樣的血清型。

McArdle 等利用6 個(gè)抗FCV-F9 株的MAbs 檢測(cè)了55個(gè)FCV 分離株，結(jié)果顯示F9 株與6 個(gè)MAbs 均反應(yīng)，而一些野毒株與任何一個(gè)都不反應(yīng)。有口腔/呼吸癥狀組的分離株很少與MAbs 反應(yīng)，表明這些毒株與F9 株相關(guān)性低，同時(shí)顯示即使與F9 株密切相關(guān)的病毒株，也不能與6 個(gè)MAbs 都發(fā)生反應(yīng)[27]。Lauritzen 等通過(guò)血清稀釋的中和試驗(yàn)確定了來(lái)自美國(guó)和英國(guó)的181 個(gè)FCV 分離株與5個(gè)參考株的抗原關(guān)系，參考株包含2 個(gè)疫苗株(F9，2280)和3 個(gè)野毒株(H，J，TN)。只有少量的英國(guó)株能夠被所有參考株的特定血清中和，沒(méi)有任何一個(gè)參考株在美國(guó)所有地理位置都占據(jù)主導(dǎo)，2280、H、J 株的抗血清能中和最高數(shù)量的分離株，F(xiàn)9 株與來(lái)自1958 年～1979 年間的分離株抗原相似性達(dá)到86 %，與來(lái)自1980 年～1995 年間的分離株抗原相似性降至43 %，J 株維持它的抗原相關(guān)性，與最近40 年的分離株代表的相似性達(dá)到75 %[28]。Rinaldo等通過(guò)體外中和試驗(yàn)，評(píng)估了F9 株與從意大利具有FCV感染臨床癥狀貓中分離的野毒株的抗原相關(guān)性，確定了F9 株和貓群中蔓延的FCV 株相關(guān)性低[29]。Addie 等通過(guò)8個(gè)感染F9、255、FCVG1 和FCV431 的貓產(chǎn)生的抗血清檢測(cè)了來(lái)自英國(guó)的110 個(gè)FCV 野毒株的交叉中和易感性，研究顯示抗新疫苗株FCVG1 或FCV431 抗血清比抗F9 和255 抗血清能中和更大比例的野毒株[30]。

FCV 抗原的多樣性是當(dāng)前疫苗免疫失敗的主要原因，衣殼蛋白基因可變區(qū)免疫主導(dǎo)位點(diǎn)的抗原多樣性解釋了逃逸突變體的出現(xiàn)[31]。一些研究認(rèn)為FCV 抗原的變異來(lái)自疫苗引起的免疫壓力[13,28]?？乖亩鄻有砸馕吨鴽](méi)有疫苗能中和所有的病毒分離株，這對(duì)于篩選制備疫苗的抗原帶來(lái)困難。

3 結(jié)語(yǔ)

FCV 基因多樣性導(dǎo)致不同病毒株對(duì)宿主組織嗜性的不同，從而引起了致病性的改變，F(xiàn)CV 除了能引起典型的呼吸、慢性胃腸炎和急性關(guān)節(jié)炎等疾病以外，還能引起VSD 和流行性出血熱樣疾病，呈現(xiàn)出不同的臨床癥狀。在美國(guó)，F(xiàn)CV 致命的突變已經(jīng)作為VSD 的一個(gè)病因，該病的特點(diǎn)是疫苗免疫的成年貓暴發(fā)性黃疸，水腫，高死亡率[8,32]。2003 年英國(guó)暴發(fā)相似的疾病[33]。2009 年法國(guó)暴發(fā)了VSD，其癥狀、病程、臨床結(jié)果和病變是典型的FCV引起的VSD[34]，但各地引發(fā)VSD 的FCV 株各不相同。2013 年意大利出現(xiàn)了第一例疑似FCV-VSD，臨床、尸檢和實(shí)驗(yàn)室研究表明與之前報(bào)道的FCV-VSD 類似。發(fā)病貓同時(shí)感染了貓免疫缺陷病毒(Feline immunodeficiency virus，F(xiàn)IV)，而其他的貓盡管直接接觸病貓也沒(méi)有感染，表明FIV 感染可能有利于致病性FCV 株的增殖[35]。2000 年一個(gè)新的高致病性FCV 株引起貓流行性出血熱樣疾病[32]。2003 年一個(gè)小動(dòng)物醫(yī)院暴發(fā)了24 例不尋常的致命FCV 感染，環(huán)境和癥狀與在北部加利福尼亞暴發(fā)的FCV 出血性疾病相似[8]。

綜上所述由FCV 引起的疾病變得難于控制，迫切地需要研制新型有效的疫苗。我們實(shí)驗(yàn)室正在致力于FCV 的反向遺傳研究，希望能從DNA 水平上對(duì)FCV 基因組進(jìn)行體外操作，研制出能抵御FCV 感染發(fā)病的新型疫苗。

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