韋冠東，張?jiān)危瑴略?，曾智勇，馬 萍，劉 霞，王洪光，李 達(dá)

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴陽(yáng) 550008）

DNA疫苗的免疫效果受動(dòng)物個(gè)體差異的影響較大，如何提高和改善DNA疫苗的免疫效果是當(dāng)今DNA疫苗研究的熱點(diǎn)，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)：與DNA疫苗聯(lián)合應(yīng)用的細(xì)胞因子可通過(guò)不同的環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)和增強(qiáng)DNA疫苗免疫效應(yīng)，白細(xì)胞介素作為免疫佐劑能協(xié)同DNA疫苗取得較好的免疫效果。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用白細(xì)胞介素IL-2和IL-4等作為疫苗的免疫佐劑已成為免疫佐劑的研究熱點(diǎn)。本文主要綜述了IL-2和IL-4作為免疫佐劑對(duì)病毒保護(hù)性抗原基因真核表達(dá)的影響，以期為更深入地進(jìn)行IL-2和IL-4對(duì)DNA疫苗增強(qiáng)作用的深入研究提供參考。

1 IL-2和IL-4的生物學(xué)作用

白細(xì)胞介素作為免疫分子佐劑已經(jīng)在多種傳染性疾病的防治領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，其中IL-2的應(yīng)用最為普遍，其次為IL-4。

IL-2是活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的Th1細(xì)胞的特征性因子，雖然其沒(méi)有直接的抗病毒活性，但其能刺激T淋巴細(xì)胞快速增殖和分化，并產(chǎn)生多種其它細(xì)胞因子如IFN-γ，IL-4，IL-S，IL-6，TNF-β及CSF等，對(duì)免疫應(yīng)答具有廣泛的上調(diào)作用。IL-2能夠維護(hù)整個(gè)NK細(xì)胞的活化、分化和增殖，調(diào)節(jié)NK細(xì)胞并保持其自然殺傷力；誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生和增殖；誘導(dǎo)淋巴因子活化淋巴細(xì)胞產(chǎn)生；具有促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖、分化作用；以及協(xié)同其他白細(xì)胞介素發(fā)揮作用。

IL-4是活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的Th2細(xì)胞的特征性因子，能夠促進(jìn)以Th2細(xì)胞為特征的免疫應(yīng)答，增強(qiáng)B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答。對(duì)于B細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等都有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠調(diào)節(jié)T、B淋巴細(xì)胞的分化、活化；增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞功能；協(xié)助基因疫苗持續(xù)表達(dá)高水平特異性抗體。隨著對(duì)其免疫調(diào)節(jié)作用研究的深入，發(fā)現(xiàn)IL-4基因與高效表達(dá)載體組成重組質(zhì)?？梢蚤L(zhǎng)時(shí)間持續(xù)表達(dá)，增強(qiáng)基因疫苗的免疫原性，提高機(jī)體免疫防御能力，有效發(fā)揮佐劑效應(yīng)。

2 IL-2和IL-4對(duì)病毒抗原基因真核表達(dá)影響的研究

許多研究發(fā)現(xiàn)：利用細(xì)胞因子IL-2和IL-4全基因分別構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒普遍能提高病毒抗原基因真核表達(dá)的效果。

陳慧慧[1]等所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了CPVVP2、cIL-2和cIL-7真核表達(dá)載體，同時(shí)利用含內(nèi)部核蛋白進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）的真核表達(dá)載體構(gòu)建了cIL-2和cIL-7雙基因表達(dá)質(zhì)粒。對(duì)4組小鼠分別進(jìn)行VP2單免疫、VP2+cIL-2、VP2+cIL-7和VP2+cIL-2/cIL-7共免疫，結(jié)果顯示共免疫組小鼠血清的抗體滴度和中和抗體效價(jià)均高于VP2單免疫，同時(shí)VP2+cIL-2/cIL-7共免疫組顯著高于VP2+cIL-2和VP2+cIL-7共免疫組(P＜0.05 )，表明cIL-2和cIL-7基因?qū)PV VP2 DNA疫苗免疫原性具有明顯的協(xié)同效應(yīng)。希尼尼根[2]等構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-IL-2，將pcDNA-IL-2與pcDNA-PRRSVSC2-ORF5共同免疫仔豬。實(shí)驗(yàn)設(shè)pcDNA-IL-2與pcDNA-PRRSVSC2-ORF5共 免 疫 組、pcDNAPRRSV-SC2-ORF5單 免 疫 組、pcDNA3.1（+）空載體和滅菌水免疫組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pcDNA-IL-2與pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5共同免疫組和pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5共同免疫組的IgG含量、CD+和CD+48細(xì)胞比例、外周血T淋巴細(xì)胞的增殖活性與單免疫組相比均顯著增高。說(shuō)明豬pcDNA IL-2具有促進(jìn)體液免疫和細(xì)胞免疫功能的作用，能顯著提高pcDNAPRRSV-ORF5基因疫苗的免疫效果。

張建遠(yuǎn)[3]等用構(gòu)建的pcDNAPCV-ORF2重組質(zhì)粒與5種細(xì)胞因子質(zhì) 粒（IL-6/4、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-Y真核表達(dá)質(zhì)粒）聯(lián)合對(duì)仔豬進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)。免疫后通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定血液中CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞亞類的數(shù)量以及間接ELISA法測(cè)定豬圓環(huán)病毒II型特異性抗體IgG，結(jié)果顯示CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞亞類的數(shù)量及特異性抗體IgG均顯著增高，說(shuō)明細(xì)胞因子質(zhì)粒（IL-6/4、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-Y真核表達(dá)質(zhì)粒）均可顯著提高DNA疫苗的免疫效果。

貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院湯德元[4]等構(gòu)建的豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-ORF5和pcDNA-IL-2、pcDNA-IL-4并 免疫仔豬，實(shí)驗(yàn)設(shè)pcDNA-ORF5免疫組、pcDNA-ORF5+pcDNA-IL-2免疫 組、pcDNA-ORF5+pcDNA-IL-4免疫組和pcDNA-ORF5+pcDNAIL-2+pcDNA-IL-4聯(lián)合免疫組。結(jié)果顯示真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4可以增強(qiáng)機(jī)體對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征核酸疫苗pcDNAORF5的免疫應(yīng)答，且pcDNAORF5+pcDNA-IL-2+pcDNA-IL-4聯(lián)合免疫組的免疫增強(qiáng)效果更為顯著。

3 IL-2和IL-4分別與病毒抗原基因構(gòu)建融合真核表達(dá)載體的研究

利用IL-2和IL-4分別與抗原基因構(gòu)建的融合雙表達(dá)重組質(zhì)粒應(yīng)用可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)DNA疫苗的免疫應(yīng)答。

陳創(chuàng)夫等構(gòu)建豬瘟病毒E2基因與IL-2、IL-3基因的真核雙表達(dá)載體（pIRST IL-2，pIRST IL-3），并將其分別導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，觀察其表達(dá)水平，及IL-2、IL-3對(duì)DNA疫苗的免疫增強(qiáng)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示pIRST IL-2、pIRST IL-3所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)比使用單表達(dá)質(zhì)粒pIRST強(qiáng)，表明IL-2、IL-3作為基因佐劑能明顯增強(qiáng)豬瘟基因疫苗的免疫效果。肖義蓉[5]等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pcDNA-IL-2與pcDNAEIII'.VP2共表達(dá)組與pcDNA-IL2-EIII'.VP2融合表達(dá)組JEV/PPV抗體水平明顯高于空載體對(duì)照組，說(shuō)明IL-2重組質(zhì)粒能顯著增強(qiáng)核酸疫苗免疫原性，其中融合基因形式構(gòu)建的真核質(zhì)粒pcDNA-IL2-EIII'.VP2免疫增強(qiáng)效果更明顯。徐凱等將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCI-IL-2-ORF2'-VP2免疫BALA/c鼠，同時(shí)設(shè)立豬細(xì)小病毒滅活苗組、豬圓環(huán)病毒亞單位苗組和pCI空載體對(duì)照組，以檢測(cè)免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化功能，外周血T淋巴細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化及血清PCV2、PPV抗體效價(jià)。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pCI-IL-2-ORF2'-VP2二免后小鼠均產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，其中脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能，CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和血清PPV/PCV2抗體的OD值均高于或顯著高于其他3組。表明豬IL-2作為基因佐劑能顯著增強(qiáng)VP2/ORF2'核酸疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。

貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院湯德元、王洪光[6]等將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-gE1，pcDNA3.1(+)-IL-2，pcDNA3.1(+)-gE2-IL-2分別免疫小鼠和仔豬，實(shí)驗(yàn)設(shè)pcDNA3.1(+)-gE1免 疫 組，pcDNA3.1(+)-IL-2免 疫 組，pcDNA3. 1(+)-gE1和pcDNA3.1(+)-IL-2聯(lián)合免疫組，pcDNA3.(+)-gE2-IL- 2融合蛋白免疫組，空載體組和生理鹽水組。結(jié)果顯示聯(lián)合免疫組及融合蛋白免疫組小鼠和仔豬血清抗體效價(jià)均高于其他實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)聯(lián)合免疫高于融合蛋白免疫組，但差異不顯著，說(shuō)明聯(lián)合免疫組及融合蛋白免疫組均能一定程度誘導(dǎo)小鼠和仔豬產(chǎn)生體液免疫；聯(lián)合免疫組及融合蛋白免疫組小鼠和仔豬CD4+、CD8+、CD4+CD8+淋巴細(xì)胞水平均顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)聯(lián)合免疫組顯著高于融合蛋白免疫組，說(shuō)明聯(lián)合免疫組及融合蛋白免疫組誘導(dǎo)小鼠和仔豬產(chǎn)生細(xì)胞免疫，但效果不顯著。

細(xì)胞因子IL-2和IL-4真核表達(dá)質(zhì)粒與病毒抗原基因構(gòu)建的真核表達(dá)載體聯(lián)合免疫動(dòng)物、細(xì)胞因子IL-2和IL-4與病毒抗原基因構(gòu)建的融合雙表達(dá)重組質(zhì)粒免疫動(dòng)物，兩者都能增強(qiáng)真核表達(dá)的效果，但關(guān)于兩者之間免疫效果的比較研究沒(méi)有得到一致結(jié)論，也有許多實(shí)驗(yàn)表明：并非所有融合蛋白都發(fā)揮出其預(yù)想的協(xié)同效應(yīng)，這可能是由于相連的兩種分子在肽鏈折疊過(guò)程中相互干擾，不能形成天然空間構(gòu)型，從而影響了其生物學(xué)活性有關(guān)，由此可見(jiàn)，無(wú)論是細(xì)胞因子IL-2和IL-4真核表達(dá)質(zhì)粒與病毒抗原基因構(gòu)建的真核表達(dá)載體聯(lián)合免疫動(dòng)物或者是細(xì)胞因子IL-2和IL-4與病毒抗原基因構(gòu)建的融合雙表達(dá)重組質(zhì)粒免疫動(dòng)物，其免疫效果，都有待于進(jìn)一步深入研究。

細(xì)胞因子用作免疫佐劑誘導(dǎo)基因疫苗發(fā)揮更有效的免疫作用是未來(lái)基因疫苗發(fā)展的趨勢(shì)，相信隨著分子免疫學(xué)和疫苗研究等相關(guān)學(xué)科迅速發(fā)展，利用細(xì)胞因子作為免疫佐劑疫苗的免疫開(kāi)發(fā)研究會(huì)克服重重困難取得預(yù)期的效果。

[1] 陳慧慧. IL-2與IL-7基因?qū)θ?xì)小病毒VP2DNA疫苗的協(xié)同免疫增強(qiáng)作用[D].河北農(nóng)業(yè) 大學(xué)，2013.

[2] 希尼尼根，程安春，汪銘書(shū)，等. 豬IL-2真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及對(duì)PRRSVORF5基因疫苗免疫佐劑作用的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007（9）：1003-1008.

[3] 張建遠(yuǎn)，王紅寧，陳錦銳，等. 豬圓環(huán)病毒核酸疫苗pcDNA-PCV-ORF2-ISS的構(gòu)建及分子佐劑聯(lián)合免疫研究[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，12：1511-1515.

[4] Deyuan Tang， Jian Liu， Chunyan Li， et al.Positive effects of porcine IL-2 and IL-4 on virus- specific immune responses induced by the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) ORF5 DNA vaccine in swine[J]. Vet Sci. Mar 2014，15(1)：99-109.

[5] 肖義蓉，王印，郭萬(wàn)柱，等. 豬IL-2對(duì)pcDNA-E39.VP2真核共表達(dá)質(zhì)粒免疫原性的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，31（7）：937-941.

[6] 王洪光，郝飛，湯德元，等. 偽狂犬病病毒gE基因DNA疫苗在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答及IL-2對(duì)其作用影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，45(9)：1488-1496.