陳 思，羅光彬，王輝田，孫 超

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110161）

體細胞核移植是將供體細胞核移入去核的卵母細胞中，使后者不經(jīng)精子穿透等有性過程即被激活、分裂并發(fā)育，讓核供體的基因得到完全復(fù)制，經(jīng)過體外培養(yǎng)后，將發(fā)育良好的胚胎移植到動物體內(nèi)的技術(shù)[1]。近年來，體細胞克隆豬在建立人的動物疾病模型和人類器官移植，進行基因工程藥物生產(chǎn)和臨床醫(yī)學(xué)克隆治療等方面具有巨大的應(yīng)用潛力，己成為當(dāng)今體細胞克隆研究的熱點。盡管豬體細胞核移植已經(jīng)取得了很大的進展，但移植效率依然很低，只有少量的重構(gòu)胚胎能最終發(fā)育成為克隆動物；這是因為在豬的體細胞核移植過程中，實驗操作步驟繁瑣，影響因素較多，任何一個操作步驟和制約因素都將導(dǎo)致效率的降低或移植失敗。為了提高豬體細胞核移植效率，有必要對豬體細胞核移植過程中的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)進行分析和優(yōu)化，對影響豬體細胞核移植的因素進行探討研究。

1 國內(nèi)外豬體細胞克隆的研究現(xiàn)狀

1997“多莉”羊誕生，揭開了體細胞克隆的序幕，2000年，Polejaeva等得到首例體細胞克隆豬之后，Onishi和Bet-thauser等相繼分別成功地得到了體細胞克隆豬，2003年，Sanghwan等克隆出了表達強熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因豬，Jagdeece等克隆出了敲除α-1，3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的克隆豬，從而為人類培育異種器官移植豬跨進了一大步。在國內(nèi)，李寧教授已于2005 年成功培養(yǎng)出我國首例克隆豬[2]；竇忠英等用胚胎細胞核移植產(chǎn)生6頭豬；魏慶信等得到了胚胎細胞核移植豬；李光鵬等把豬體細胞胚胎的細胞核通過電融合移植到去核的體內(nèi)和體外成熟卵母細胞中，出生了2頭克隆豬；孫興參等獲得了豬卵丘細胞克隆囊胚；2003年馮秀亮得到了人體細胞和豬卵母細胞異種核移植囊胚[3]。盡管如此，豬的體細胞克隆效率很低，與其他動物相比核移植難度更大，這是因為豬的卵子體外成熟胞質(zhì)成熟不完全，發(fā)育能力不如體內(nèi)獲得的卵子；胞質(zhì)較黑，較難顯微操作；胞質(zhì)內(nèi)富含脂滴，對溫度極其敏感；至少需要四枚優(yōu)質(zhì)胚胎才能建立和維持妊娠等。許多有關(guān)環(huán)節(jié)的機制還不清楚，本文就影響豬體細胞核移植主要因素的研究進展情況進行了綜述。

2 供體細胞對核移植效果的影響

2.1 供體細胞的來源和種類對核移植的影響

多種組織來源的體細胞如乳房上皮細胞、各種成纖維細胞、卵丘/顆粒細胞、輸卵管上皮細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、睪丸支持細胞、神經(jīng)細胞都可以用于克隆動物，但來源于不同組織或細胞種類的細胞的重編程能力和核移植效率明顯不同。有些種類的供核細胞雖然能夠得到克隆囊胚，但沒有獲得克隆后代；以克隆豬為例，目前只有豬的胎兒成纖維細胞和卵丘/顆粒細胞作為供體細胞成功地獲得了核移植后代。張德福等對比了成纖維細胞、顆粒細胞、輸卵管上皮細胞等，發(fā)現(xiàn)成纖維細胞和顆粒細胞形成重構(gòu)胚后囊胚發(fā)育率較高。

2.2 供體細胞動物年齡對核移植的影響

供體細胞的年齡對核移植效率存在一定的影響，多數(shù)研究表明，在核移植過程中，采用來源于胚胎和新生動物的細胞作為供核細胞，其克隆胚胎具有相似的囊胚發(fā)育率，但胎兒細胞卻更容易得到健康的新生動物。這可能是由于胎兒細胞的分化程度較低，在重組胚中更容易啟動重編程，而成體動物由于年齡較大，體細胞分化程度高，積累了較多的損傷和突變，因此導(dǎo)致重組胚胎發(fā)育能力降低。但也有研究認為，體細胞克隆胚胎的發(fā)育率與供體細胞動物的年齡無關(guān)。張運海研究認為在1～10代內(nèi)不影響豬重構(gòu)胚的發(fā)育能力。采用傳代早期的細胞，這樣似乎更有利于核移胚的發(fā)育，研究表明采用6～9代的供體細胞重構(gòu)胚的發(fā)育能力較佳。Kubota研究5～15代之間重構(gòu)胚發(fā)育能力差異不顯著，Kasinathan等采用18代細胞為供核，不影響核移植重組胚的發(fā)育潛力[4]。

2.3 供核細胞的細胞周期對核移植的影響

細胞周期是指親代細胞從分裂完成開始到子代細胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的時間，由G1、S、G2和M期組成，G1期為DNA合成的準備階段，此時細胞核為二倍體，S期為DNA合成期，G2期是S期向分裂期過度階段，該期細胞核為四倍體。研究認為，供體細胞的細胞周期也是影響核移植的一個重要因素，只有供核細胞和受體卵母細胞的細胞周期相協(xié)調(diào)時，卵母細胞的胞質(zhì)才能有效對移入的核發(fā)生分化，并重新激活它的發(fā)育程序。

在動物核移植研究之初，認為供體核應(yīng)該處于G1期或G0期，因為處G0和G1期的供體細胞不會因為DNA復(fù)制而產(chǎn)生多倍體。而G2和S期的細胞因DNA已合成或復(fù)制，會導(dǎo)致克隆胚發(fā)育不正常[5]。但在隨后的研究中，賴良學(xué)等研究發(fā)現(xiàn)G2/M期的細胞能在去核MII期的豬卵母細胞中重新編程，并獲得了體細胞克隆豬。此外，其他人的研究證實，G1、G2、M期的細胞均可用于核移植[6]。目前，除S期外，處于其他任何細胞周期的細胞都能成功用于克隆[7]。盡管如此，目前大多數(shù)實驗仍是采用血清饑餓法和接觸抑制法獲得的GO/Gl期細胞，認為這種細胞較其他細胞周期的細胞更有利于重編程。

3 受體細胞對核移植效果的影響

3.1 受體細胞的選擇及其影響

受體細胞所處的階段對核移植的效果有著重要影響，在哺乳動物核移植研究中，作為受體胞質(zhì)主要有三類：去核受精卵（原核胚胎）、2-細胞胚胎及去核MⅡ期成熟卵母細胞，其中卵母細胞的應(yīng)用最為廣泛。雖然采用去核受精卵的細胞作核受體已經(jīng)得到克隆動物，但Singer等研究證明當(dāng)用去核受精卵作核移植受體時，受體胞質(zhì)所接受的胚胎核供體發(fā)育不能超過2～3細胞階段，否則其重組胚無法正常發(fā)育。Wilmut研究認為處于MⅡ期卵母細胞有利于胚胎的重組，這是因為胚胎重組所需要的因子存在與MⅡ卵母細胞質(zhì)中，在此時期，如轉(zhuǎn)錄因子等蛋白質(zhì)從DNA螺旋軸中脫離，允許大量重組因子結(jié)合與DNA螺旋軸上，有利于重組發(fā)生。卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)是獲取大量受體細胞的主要途徑；豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)及體外發(fā)育能力與成熟液和培養(yǎng)條件有密切的聯(lián)系，現(xiàn)在普遍用兩種基本的成熟培養(yǎng)基礎(chǔ)液NCSU-23和TCM199。有人比較兩種培養(yǎng)液的成熟效果，發(fā)現(xiàn)兩者在成熟率上不存在顯著差異，但其體外重組胚的發(fā)育差異顯著。一般有2種培養(yǎng)條件。①38.5 ℃、5%的CO2、95%的空氣；② 38.5 ℃、5% 的 CO2、5% 的 O2、90%的N2，研究表明在不同氧濃度下盡管囊胚形成率沒有區(qū)別，但囊胚中的細胞數(shù)在氧濃度為5%時較多。選擇合適卵齡的成熟卵母細胞作為胞質(zhì)受體對核移植有很大的影響。一般選擇成熟培養(yǎng)40～44 h的卵母細胞。

3.2 受體細胞去核方法及其影響

受體卵母細胞的完全去核是保證核移植胚胎發(fā)育的基本條件，如果去核不完全，可導(dǎo)致重組胚染色體的非整倍體性、卵裂異常、發(fā)育受阻和胚胎早期死亡。卵母細胞快速而準確的去核可避免孤雌發(fā)育，縮短體外操作時間，減少實驗中的干擾因素。一般有以下幾種方法[8]，①活性熒光染料（Hoeches33342）定位法，該方法去核準確，但染料和紫外線對卵母細胞有毒害作用，所以去核時間不能過長；②盲吸法，該法技術(shù)要求高、耗費時間長、對卵母細胞損傷嚴重、影響細胞質(zhì)空間結(jié)構(gòu)；③點壓法，該法對卵母細胞質(zhì)損傷較小，去核時不用換針，能有效提高去核效率；④化學(xué)誘導(dǎo)去核法，利用脫羰秋水仙堿的作用，使MII期卵母細胞排出第二極體，從而完成去核；⑤紡錘體探測技術(shù)，是利用Spindle-view偏振光系統(tǒng)，顯示MII期染色體所處位置，并通過顯微操作法去核，去核準確。

3.3 受體細胞注核的影響

按照供體細胞移入部位的不同，注核一般分為胞質(zhì)內(nèi)注射和透明帶下注射。胞質(zhì)內(nèi)注射一般用Piezoactuation（壓電-陶瓷系統(tǒng)）微注射系統(tǒng)，直接把供體核注入胞質(zhì)內(nèi)。透明帶下注射則把整個供核細胞注射至卵周隙，并需要融合。目前也有研究者直接把整個供核細胞注入胞質(zhì)內(nèi)，不需要融合而且效果非常好，其囊胚形成率達37%[9]。這可能是：①移入的供核細胞的細胞膜會逐漸在胞質(zhì)受體中消失；②這樣做不需要進行融合，減少了體外操作時間；③移入的胞質(zhì)成分也許對重構(gòu)胚的進一步發(fā)育很重要；④確保了DNA 能完全進入去核的卵母細胞，避免了獲得供體核過程中對其結(jié)構(gòu)的損壞，能更有效地支持重組胚的發(fā)育。

4 細胞融合對核移植效果的影響

當(dāng)供核細胞通過帶下注核移入除去細胞核的受體卵母細胞時，供核細胞仍然由獨自的細胞膜包圍著，只有通過細胞融合，才能使供核細胞與受體卵母細胞形成卵核復(fù)合體，也就是成為一個完整細胞繼續(xù)培養(yǎng)。目前許多研究都是應(yīng)用電融合技術(shù)進行融合，電融合是通過在短時間強電場的作用下，使細胞的雙層膜產(chǎn)生可逆性擊穿，當(dāng)這種擊穿發(fā)生在相鄰的細胞膜接觸區(qū)域時，兩側(cè)的細胞膜瞬間接觸并融合。由于該方法重復(fù)性好、細胞毒性小、融合效果好，后來逐步被廣大研究人員采納，將電融合應(yīng)用于胚胎細胞的融合，成為主要的融合方式。目前已有綿羊、牛、山羊、豬等動物采用電融合法獲得了克隆動物[10]。對融合效率有直接影響的因素包括電脈沖強度、持續(xù)時間和脈沖次數(shù)等，電脈沖強度影響孔的數(shù)目和大小，持續(xù)時間影響微孔的存在時間[11]。另外，在施加直流脈沖前施加交流電，可以使細胞產(chǎn)生極化，促使細胞膜緊密接觸并使接觸面垂直于電極，從而提高融合效率。

5 激活對核移植效果的影響

在核移植過程中，因缺乏自然受精過程中的激活，需要使用物理或化學(xué)刺激，使卵母細胞激活后繼續(xù)發(fā)育。Ca2+信號途徑下游通路可導(dǎo)致卵母細胞激活，所以，創(chuàng)造一個短暫的Ca2+波動是激活過程的關(guān)鍵，但這個過程往往難以完全復(fù)制自然受精過程中Ca2+波動。Ozi和Hunean的研究認為[12]，Ca2+波動的幅度、數(shù)量、頻度對早期胚胎的分裂影響不大，但Ca2+波動與胚胎發(fā)育的效率和質(zhì)量有密切關(guān)系。目前主要有3種激活方案：①融合前激活，②融合同時激活，③融合后激活。激活后的卵母細胞，MPF活性降低，不會使移入其中的細胞發(fā)生PCC，阻止了G2期供體染色體的再復(fù)制現(xiàn)象，而Gl期和S期供體核仍可繼續(xù)進行正常DNA復(fù)制，因而處于Gl，S，G2期的供核細胞仍繼續(xù)原來的周期進程，保持正常核型。體細胞核移入去核的未激活的MII期卵母細胞后，在卵胞質(zhì)中高活性MPF作用下，發(fā)生核膜破裂和染色體凝集。染色體的凝集將加速核與胞質(zhì)中與核重編程相關(guān)蛋白因子的交換，促進基因組重編程的進行。染色體凝集也會對處于不同細胞周期的供體核倍性產(chǎn)生影響。處于Gl/GO期的細胞，因為DNA尚未復(fù)制，其核為二倍體，當(dāng)染色質(zhì)凝集后仍為二倍體，重構(gòu)胚可以正常發(fā)育。G2期細胞作核供體時，由于DNA已復(fù)制，染色質(zhì)凝集形成4倍體，必須使一半染色體以極體形式排出才能維持染色體的正常倍性，否則重構(gòu)胚將維持異倍性而不能正常發(fā)育。而處于S期的供體核其DNA正處于復(fù)制過程中，此時發(fā)生PCC將使染色質(zhì)形成“粉末狀”形態(tài)，造成DNA嚴重損傷，重構(gòu)胚不能正常發(fā)育[13]。

電脈沖和化學(xué)物質(zhì)對能激活卵母細胞，但激活的同時不可避免地造成卵母細胞的損傷。因此，摸索出激活效率高，對卵母細胞損傷小的激活方法對胚胎的發(fā)育至關(guān)重要。

6 胚胎體外培養(yǎng)和胚胎移植對核移植效果的影響

胚胎的體外培養(yǎng)已有30多年的發(fā)展歷史，體外培養(yǎng)技術(shù)作為基礎(chǔ)技術(shù)廣泛地用于胚胎工程各個方面，但胚胎體外培養(yǎng)的效率還不高，并且體外生產(chǎn)的胚胎染色體倍型的異常率較體內(nèi)胚高出許多，rRNA基因的活性也明顯不同，研究表明體外培養(yǎng)系統(tǒng)的缺陷也是導(dǎo)致胚胎吸收、死亡、流產(chǎn)、死胎或出生后死亡的一個重要方面，這說明現(xiàn)有各種培養(yǎng)系統(tǒng)還無法完全模仿體內(nèi)環(huán)境，以適應(yīng)早期早期胚胎分化發(fā)育的需求。這也就需要人們對早期胚胎的發(fā)育機制作更深地探索，在改善培養(yǎng)系統(tǒng)時，不只是單純的通過添加或去除某種成分或改變某種物質(zhì)的濃度來實現(xiàn)，而要從細胞代謝生理角度上摸索體外胚胎在早期發(fā)育過程中的實際需要，從而進一步了解早期胚胎的發(fā)育機制，進而提高體外生產(chǎn)胚胎的質(zhì)量。

選擇合適的培養(yǎng)液和培養(yǎng)條件對重構(gòu)胚胎的發(fā)育至關(guān)重要，為了減少體外培養(yǎng)環(huán)境對胚胎發(fā)育的不利影響，豬體細胞重構(gòu)胚胎要盡可能早地移植入雌性體內(nèi)?？寺∨咛サ囊浦卜椒ê团咛ヒ浦卜椒ㄏ嗤?，關(guān)鍵是要保證移入胚胎的時期和受體母畜的生理周期一致。

7 存在的問題

盡管體細胞克隆豬研究已在理論基礎(chǔ)、技術(shù)優(yōu)化等方面取得很大的進展。但該技術(shù)目前還很不完善，相關(guān)理論研究還很薄弱，還存在許多問題，比如核移植的效率很低、存活率低、核移植動物的異常發(fā)育、端粒長度縮短等問題，人們要提高動物克隆的成功率需不懈的努力。這些問題的解決，將有助于加深人們對動物胚胎發(fā)育的過程中分子機制的認識。因此，今后研究應(yīng)該著重于有關(guān)核重新編程分子機制的研究以及胞質(zhì)線粒體的影響等。

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