張青峰，張芳婷，申慧芳，高書穎

(1.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 廣東 珠海 519041；2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518036)

端粒 (telomere) 位于染色體末端，是由串聯(lián)重復(fù)的短雙鏈DNA序列和結(jié)合蛋白形成的復(fù)合體，在維持基因組完整性和功能穩(wěn)定性方面有著重要作用。重復(fù)端粒DNA序列由端粒酶維護(hù)。人端粒酶由端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTERT)、端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 和端粒酶相關(guān)蛋白 (additional protein components) 組成，hTERT的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是限制端粒酶活性的主要因素[1]。研究發(fā)現(xiàn)，hTERT在大多數(shù)正常人體細(xì)胞中呈低表達(dá)或不表達(dá)，而在胚胎發(fā)育期間、在一些干細(xì)胞和大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)活性[2]。表達(dá)外源hTERT，可以使某些類型的細(xì)胞永生化，其中包括馬科動(dòng)物原代成纖維細(xì)胞[3]、人間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞[4]、人口腔黏膜上皮細(xì)胞[5]、人肝細(xì)胞[6]等。

本研究擬構(gòu)建攜帶hTERT基因的重組慢病毒表達(dá)載體，制備重組慢病毒，檢測(cè)攜帶hTERT基因的重組慢病毒對(duì)HeLa細(xì)胞的感染能力，及其介導(dǎo)外源hTERT基因在被感染細(xì)胞中的染色體整合和mRNA表達(dá)水平，為進(jìn)一步研究hTERT基因的功能及構(gòu)建永生化細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與質(zhì)粒 人宮頸癌HeLa細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；人胚腎293FT細(xì)胞、大腸桿菌Stbl3、質(zhì)粒pENTR 221-hTERT、pLP1、pLP2、pLP/VSVG和pLenti6.3/V5-DEST等購(gòu)自Invitrogen公司 (Carlsbad, CA, USA)。重組質(zhì)粒pLenti6.3/V5-hTERT由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，其結(jié)構(gòu)示意圖(見(jiàn)圖1)。

圖1 重組質(zhì)粒pLenti6.3/V5-hTERT的結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 主要試劑 質(zhì)粒提取試劑盒、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000、LR clonase II enzyme mix和殺稻瘟菌素 (BSD) 等購(gòu)自Invitrogen公司 (Carlsbad, CA, USA)；Taq DNA聚合酶EmeraldAmp PCR Master Mix、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和PstⅠ購(gòu)自Takara公司 (Dalian, China)；慢病毒濃縮試劑盒PEG-it Virus Precipitation Solution購(gòu)自System biosciences公司 (Mountain View, CA, USA)；Polybrene購(gòu)自Sigma公司 (St. Louis, MO, USA)。

1.3 重組慢病毒載體pLenti6.3/V5-hTERT的構(gòu)建及酶切鑒定 將克隆載體pENTR221-hTERT、表達(dá)載體pLenti6.3/V5-DEST和LR Clonase II enzyme mix于室溫下混合均勻，孵育1～2 h，然后加入Proteinase K溶液終止反應(yīng)，于37 ℃孵育樣品10 min。將上述反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Stbl3細(xì)胞，在含有Amp抗生素的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆。提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和PstⅠ分別單酶切質(zhì)粒，鑒定目的片段的大小和連接方向。

1.4 慢病毒的包裝與濃縮 將293FT細(xì)胞接種至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，293FT細(xì)胞密度為80%～95%時(shí)，依照轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000操作說(shuō)明將pLP1、pLP2、pLP/VSVG和pLenti6.3/V5-hTERT四種質(zhì)粒混合，共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，轉(zhuǎn)染第2天，除去293FT細(xì)胞培養(yǎng)基，更換為10 mL不含抗生素的DMEM完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞48～72 h。將培養(yǎng)基上清轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，4 ℃ 2000 ×g離心15 min，沉淀碎片，使用Millex-HV 0.45 μm PVDF濾器過(guò)濾上清，得到含有慢病毒的上清液。參照慢病毒濃縮試劑盒PEG-it Virus Precipitation Solution操作說(shuō)明對(duì)慢病毒上清液進(jìn)行濃縮，分裝至1.5 mL離心管中，于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 重組慢病毒攜帶hTERT基因的PCR檢測(cè) 取慢病毒濃縮液10 μL，沸水浴15 min，迅速冰浴15 min，提取病毒DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。擴(kuò)增hTERT基因的上游引物為Primer1：5’-GGTGGATGATTTCTTGTTGGTG-3’，下游引物為Primer2：5’-ACCACTGTCTTCCGCAAGTTC-3’。 PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。實(shí)驗(yàn)設(shè)無(wú)菌水為陰性對(duì)照、質(zhì)粒pENTR221-hTERT為陽(yáng)性對(duì)照。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 重組慢病毒感染能力的鑒定 將HeLa細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，慢病毒感染當(dāng)天細(xì)胞密度為40% ～ 50%。用DMEM完全培養(yǎng)基將慢病毒貯存液稀釋100倍，滴加至HeLa細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，同時(shí)加入Polybrene至終濃度為6 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜。次日，除去含慢病毒的培養(yǎng)基，更換為新鮮DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。第3天，更換為含有10 μg/mL BSD的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。此后每3～4 d，更換新鮮的含有BSD的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，抗生素篩選10～12 d后，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

1.7 外源hTERT基因整合至HeLa細(xì)胞基因組的檢測(cè) 提取感染重組慢病毒經(jīng)BSD篩選培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞基因組DNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為Primer1和Primer2。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 HeLa細(xì)胞hTERT基因表達(dá)的RT-PCR檢測(cè) 利用TRIzol試劑 (Invitrogen公司) 提取感染重組慢病毒經(jīng)BSD篩選培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增hTERT基因的上下游引物為Primer1和Primer2，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度預(yù)計(jì)為117 bp；內(nèi)參照GAPDH基因的上游引物為Primer3：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物為Primer4：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度預(yù)計(jì)為138 bp。由于hTERT基因和GAPDH基因的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度接近，這兩種基因的PCR反應(yīng)在不同體系中進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5min。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒載體pLenti6.3/V5-hTERT的構(gòu)建 克隆載體pENTR 221-hTERT攜帶attL1和attL2位點(diǎn)，位于hTERT基因序列兩端；慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3/V5-DEST攜帶attR1和attR2位點(diǎn)，位于細(xì)胞死亡控制基因ccdB序列兩端。在LR Clonase II enzyme的作用下，pLenti6.3/V5-DEST上的attR1和attR2序列與pENTR221-hTERT上的attL1和attL2序列發(fā)生同源重組，將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Stbl3感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)Amp抗生素篩選獲得陽(yáng)性克隆。提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將重組質(zhì)粒命名為pLenti6.3/V5-hTERT，其結(jié)構(gòu)示意圖(見(jiàn)圖1)。重組質(zhì)粒pLenti6.3/V5-hTERT全長(zhǎng)11131 bp，酶切鑒定對(duì)照質(zhì)粒pENTR221-hTERT全長(zhǎng)5943 bp，兩種質(zhì)粒均含有BamHⅠ和PstⅠ酶切位點(diǎn)，單切酶后預(yù)計(jì)形成的DNA片段(見(jiàn)表1)。質(zhì)粒的單酶切片段電泳結(jié)果(見(jiàn)圖2)，圖中顯示，重組質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ酶切形成的片段大小與預(yù)計(jì)值完全一致；經(jīng)PstⅠ酶切形成的小片段亮度較弱，大片段與預(yù)計(jì)值一致。鑒定結(jié)果說(shuō)明，hTERT基因已定向連接至慢病毒表達(dá)載體，載體pLenti6.3/V5-DEST上的細(xì)胞死亡控制基因ccdB被目的基因hTERT所取代，重組慢病毒載體pLenti6.3/V5-hTERT構(gòu)建正確。

表1質(zhì)粒pLenti6.3/V5-hTERT和pENTR221-hTERT經(jīng)BamHⅠ和PstⅠ單酶切形成的DNA片段

限制性內(nèi)切酶質(zhì)粒 質(zhì)粒酶切后形成的DNA片段 (bp)BamHⅠpENTR221-hTERT5943BamHⅠpLenti6.3/V5-hTERT8578, 2553PstⅠpENTR221-hTERT3147, 1260, 825, 496, 185, 30PstⅠpLenti6.3/V5-hTERT8046, 1260, 825, 496, 289, 185, 30

2.2 重組慢病毒攜帶hTERT基因的檢測(cè) 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將攜帶hTERT基因的重組慢病毒載體pLenti6.3/V5-hTERT與包裝質(zhì)?；旌衔飌LP1、pLP2和pLP/VSVG共轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞，收集含有慢病毒顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)基上清，使用PEG-it Virus Precipitation Solution將培養(yǎng)基上清濃縮為原體積的1/50，提取慢病毒DNA，以Primer1和Primer2為引物PCR法檢測(cè)重組慢病毒中是否含有hTERT基因。PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3，以無(wú)菌水為模板的陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，以質(zhì)粒pENTR221-hTERT為模板的陽(yáng)性對(duì)照和以重組慢病毒DNA為模板的樣品有特異性擴(kuò)增片段，片段大小與預(yù)計(jì)值一致，可見(jiàn)本研究所包裝、濃縮的重組慢病毒攜帶hTERT基因。

2.3 重組慢病毒介導(dǎo)hTERT基因整合至HeLa細(xì)胞染色體DNA 將重組慢病毒感染HeLa細(xì)胞，經(jīng)BSD篩選培養(yǎng)，得到具有BSD抗性的細(xì)胞克隆，經(jīng)傳代培養(yǎng)，提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增鑒定是否含有外源hTERT基因。以Primer1和Primer2為引物擴(kuò)增HeLa細(xì)胞基因組DNA內(nèi)源hTERT基因得到的片段應(yīng)為1988 bp，其中含有內(nèi)含子序列1871 bp；擴(kuò)增外源hTERT基因得到的片段應(yīng)為117 bp，為克隆hTERT基因序列，不含有內(nèi)含子。BSD抗性HeLa細(xì)胞和對(duì)照HeLa細(xì)胞基因組DNA鑒定結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，未感染重組慢病毒的對(duì)照HeLa細(xì)胞，有1條特異性擴(kuò)增條帶 (泳道1、2中箭頭A所指)，片段大小與內(nèi)源hTERT基因擴(kuò)增片段預(yù)計(jì)值大小一致；感染重組慢病毒經(jīng)BSD篩選的HeLa細(xì)胞，有2條特異性擴(kuò)增條帶，其中大片段 (泳道3、4中箭頭A所指) 與內(nèi)源hTERT基因擴(kuò)增片段預(yù)計(jì)值大小一致，小片段 (泳道3、4中箭頭B所指) 與外源hTERT基因擴(kuò)增片段預(yù)計(jì)值大小一致。檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明，攜帶hTERT基因的重組慢病毒感染HeLa細(xì)胞后，介導(dǎo)hTERT基因整合至HeLa細(xì)胞染色體DNA。

2.4 重組慢病毒感染對(duì)HeLa細(xì)胞hTERT基因轉(zhuǎn)錄水平的影響 采用半定量RT-PCR的方法檢測(cè)BSD抗性HeLa細(xì)胞中hTERT基因的mRNA表達(dá)水平，確定重組慢病毒感染對(duì)HeLa細(xì)胞hTERT基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，結(jié)果(見(jiàn)圖5)。由圖5可見(jiàn)，內(nèi)參照GAPDH基因在感染重組慢病毒的HeLa細(xì)胞和未感染重組慢病毒的對(duì)照細(xì)胞中的表達(dá)量無(wú)明顯差異；而hTERT基因在感染重組慢病毒的HeLa細(xì)胞中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于對(duì)照細(xì)胞，說(shuō)明通過(guò)重組慢病毒介導(dǎo)而整合至HeLa細(xì)胞染色體DNA的外源hTERT基因，能夠在被感染細(xì)胞中得到高表達(dá)。

3 討論

端粒酶與腫瘤發(fā)生和細(xì)胞衰老有關(guān)[2,7]，利用分子生物學(xué)技術(shù)，將外源hTERT基因?qū)氲捅磉_(dá)或不表達(dá)hTERT的細(xì)胞中，提高細(xì)胞內(nèi)hTERT的表達(dá)水平，可以使某些類型的細(xì)胞永生化。目前，hTERT基因已被廣泛用于構(gòu)建人和其它動(dòng)物永生化細(xì)胞系[3-6,8]。慢病毒載體感染是動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源基因的常用方法。與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體等其它病毒表達(dá)載體相比，慢病毒載體的最大優(yōu)勢(shì)是能夠感染分裂和非分裂細(xì)胞，將外源基因有效地整合到宿主細(xì)胞染色體上，從而實(shí)現(xiàn)持久性表達(dá)[9]。

本研究所構(gòu)建的重組慢病毒載體pLenti6.3/V5-hTERT攜帶hTERT基因，同時(shí)含有WPRE、cPPT元件和殺稻瘟菌素篩選基因Blasticidin，提供Ψ包裝信號(hào)以及PRSV/5’LTR和ΔU3/3’LTR，能增強(qiáng)基因的表達(dá)、便于病毒包裝、利于目的基因整合至宿主細(xì)胞染色體。病毒的包裝采用四質(zhì)粒系統(tǒng)，具有以反式方式提供病毒包裝和慢病毒載體的自滅活功能，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)操作的安全性[10-11]。本研究通過(guò)構(gòu)建攜帶hTERT基因的重組慢病毒載體、制備重組慢病毒，檢測(cè)攜帶hTERT基因的慢病毒對(duì)HeLa細(xì)胞的感染能力，及其介導(dǎo)外源hTERT基因在被感染細(xì)胞中的染色體整合和mRNA表達(dá)水平，這些工作對(duì)于進(jìn)一步研究hTERT基因的功能及構(gòu)建永生化細(xì)胞系具有重要意義。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Osterhage J L, Friedman K L. Chromosome end maintenance by telomerase [J]. J Biol Chem, 2009,284(24):16061-16065.

[2]Shay J W, Wright W E. Telomerase therapeutics for cancer: challenges and new directions [J]. Nat Rev Drug Discov, 2006,5(7):577-584.

[3]Vidale P, Magnani E, Nergadze S G, et al. The catalytic and the RNA subunits of human telomerase are required to immortalize equid primary fibroblasts [J]. Chromosoma, 2012,121(5):475-488.

[4]Yao C L, Hwang S M. Immortalization of human mesenchymal stromal cells with telomerase and red fluorescence protein expression [J]. Methods Mol Biol, 2012,879:471-478.

[5]陳之鋒, 呂標(biāo), 鄭超群, 等. hTERT誘導(dǎo)永生化口腔黏膜上皮細(xì)胞株的建立 [J]. 中國(guó)口腔頜面外科雜志, 2013,11(2):91-96.

[6]杭化蓮, 張磊, 施曉雷, 等. 永生化人肝細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性 [J]. 江蘇醫(yī)藥, 2011,37(22):2624-2627.

[7]Aubert G, Lansdorp P M. Telomeres and aging [J]. Physiol Rev, 2008,88(2)：557-579.

[8]陳小云, 張敏, 王磊, 等. 端粒酶在細(xì)胞永生化中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)獸藥雜志, 2013,47(4):53-57.

[9]Naldini L. Lentiviruses as gene transfer agents for delivery to non-dividing cells [J]. Curr Opin Biotechnol, 1998,9(5):457-463.

[10]Zufferey R, Dull T, Mandel R J, et al. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficientinvivogene delivery [J]. J Virol, 1998,72(12):9873-9880.

[11]Buchschacher G L Jr, Wong-Staal F. Development of lentiviral vectors for gene therapy for human diseases [J]. Blood, 2000,95(8):2499-2504.