雷麗云，沈 洲，龍 蓉，陳 素，成 波，劉向明

（中南民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，湖北 武漢430074）

龍血竭又稱國產(chǎn)血竭，是傳統(tǒng)名貴中藥，系百合科龍血樹屬劍葉龍血樹 Dracaena cochinchinensis（Lour．）S．C．Chen的含脂木材經(jīng)提取得到的樹脂［1］，具有活血散瘀、定痛止血等藥理作用［1－2］。龍血素A（LA）和龍血素B （LB）為龍血竭的主要活性成分［3－4］，LA對(duì)腦缺血有一定的保護(hù)作用［5］，LB通過調(diào)制電壓門控性鈉通道和 TRPV1受體產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用［6－7］，LA和LB有望成為新的藥物前體。

目前對(duì)LA和LB含量的檢測只有高效液相色譜法［8－9］，但昂貴的儀器設(shè)備以及對(duì)操作者的專業(yè)要求限制了其應(yīng)用。酶聯(lián)免疫檢測法（ELISA）具有高通量、易操作、低成本等特點(diǎn)，在藥物檢測中已有廣泛的應(yīng)用［10］，建立靈敏便捷的測定LA和LB的ELISA方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。鑒于此，作者建立了LA和LB間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法，并將其用于LA和LB的含量測定。

1 材料

1．1 動(dòng)物

6周齡雌性BALB／c小鼠（18～22g），許可證號(hào)SCXK（鄂）2008－0005，湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。

1．2 藥品與試劑

LA標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)111660－200402）、血竭素高氯酸鹽（批號(hào)110811－201105），中國食品藥品檢定研究院；LB（純度＞98%）、劍葉LA（純度＞98%）、劍葉LB（純度＞98%）、龍血竭、龍血竭總黃酮，廣西中醫(yī)藥研究院盧文杰教授提供并鑒定；雨林牌龍血竭膠囊（批號(hào)110403），西雙版納雨林制藥有限責(zé)任公司；云杉牌龍血竭膠囊（批號(hào)111032），云南云河藥業(yè)有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、二甲基亞砜、辣椒素（capsaicin）、辣椒平（capsazepine），Sigma公司；牛血清白蛋白（BSA）、雞卵清蛋白（OVA），Biosharp公司；HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG，天津三箭生物技術(shù)有限公司；TMB雙組分顯色液A、B，鄭州博威嘉生物科技有限公司；96孔可拆酶標(biāo)板，Corning公司；總蛋白定量測試盒（BCA法），南京建成生物工程研究所；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1．3 儀器

HH－CP－T型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；101－1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司；DZF－0B6020型真空干燥箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；UV－3200PC型掃描型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；Thermo Labsystems Multiskan Ascent 354型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司。

2 方法與結(jié)果

2．1 半抗原的合成

采用溴乙酸法［11］給LA和LB加上游離羧基基團(tuán)合成半抗原，合成路線如圖1所示。

圖1 半抗原的合成路線Fig．1 Synthetic route of haptens

取LA和LB各60mg，分別溶于2mL干燥的二甲基亞砜中，各加入KOH粉末0．3g，攪拌5min后，加入溴乙酸60mg，繼續(xù)室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4h，加入冰水20mL，滴加2mol·L－1的HCl溶液酸化至溶液變?yōu)榘咨珳啙釥睿?℃過夜后，用G5砂芯漏斗過濾，沉淀物用冰蒸餾水洗滌，加丙酮收集沉淀，真空干燥得到半抗原：LA－4′－羧甲基醚（LA－4′－CME）和 LB－4′－羧甲基醚（LB－4′－CME）。

2．2 人工抗原的合成和鑒定

采用碳二亞胺法［12］將制備的半抗原與載體蛋白BSA偶聯(lián)合成完全抗原，即免疫抗原：LA－BSA和LBBSA。同法合成包被抗原：LA－OVA和LB－OVA。用總蛋白定量測試盒（BCA法）測定各人工抗原的濃度：LABSA為2．2mg·mL－1、LB－BSA為4．8mg·mL－1、LAOVA 為2．3mg·mL－1、LB－OVA 為2．4mg·mL－1。在190～300nm波長間分別掃描LA、LB、載體蛋白和人工抗原的紫外吸收光譜，結(jié)果見圖2。

圖2 LA、LB、載體蛋白和人工抗原的紫外吸收光譜Fig．2 UV Spectra of LA，LB，carrier proteins and artificial antigens

由圖2可知，人工抗原的紫外吸收光譜與載體蛋白和對(duì)應(yīng)LA或LB的紫外吸收光譜明顯不同，且在波長275nm附近人工抗原的吸收值顯著高于載體蛋白，可認(rèn)為半抗原與載體蛋白已發(fā)生偶聯(lián)。按文獻(xiàn)［13］方法，根據(jù)樣品濃度和紫外掃描的吸收值，估算各人工抗原的結(jié)合比：LA－BSA為41∶1、LA－OVA為15∶1、LB－BSA為76∶1、LB－OVA為17∶1。

2．3 動(dòng)物免疫

用免疫抗原LA－BSA和LB－BSA各免疫3只6周齡BALB／c雌鼠，免疫時(shí)取等量免疫抗原與弗氏完全佐劑（初免）或弗氏不完全佐劑（第2次和第3次免疫）混合，充分乳化后，經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射，每只注射免疫抗原25μg。第3次免疫后第10d摘小鼠眼球取血，同時(shí)取沒有免疫的小鼠血作陰性對(duì)照。全血置37℃溫箱1h，再置4℃冰箱過夜后于3 000r·min－1離心15min分離出血清，分裝后于－20℃凍存。

2．4 間接競爭酶聯(lián)免疫檢測步驟

1）將包被抗原用0．05mol·L－1、pH 值為9．6的碳酸鹽緩沖溶液稀釋至一定濃度后包被96孔酶標(biāo)板，每孔100μL，2～8℃過夜，洗滌液洗板3次后甩干。

2）每孔加封閉液（含1%脫脂奶粉的PBS）120 μL，37℃培養(yǎng)孵育2h，洗板3次后甩干，置30℃干燥箱中干燥3～4h，2～8℃密封存放，備用。

3）用PBST配制系列濃度的LA或LB標(biāo)準(zhǔn)品，包被酶標(biāo)板孔內(nèi)添加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品各50μL，各孔再添加一定稀釋度的抗血清溶液50μL，37℃孵育30min，洗板5次，甩干。

4）每孔添加稀釋5 000倍的HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG溶液100μL，37℃孵育15min，洗板5次，甩干。

5）每孔依次添加顯色液A和B各50μL，避光反應(yīng)10min，再加入2mol·L－1硫酸50μL終止反應(yīng)。

6）用酶標(biāo)儀測量450nm和630nm雙波長OD值，以（OD450－OD630）作為反應(yīng)OD 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到樣品濃度。

2．5 抗血清效價(jià)的測定

包被抗原濃度為4μg·mL－1，將各動(dòng)物抗血清稀釋至不同濃度，檢測空白樣品OD值，以O(shè)D值在0．9～1．2之間的最大抗血清稀釋度作為此抗血清的效價(jià)。經(jīng)間接ELISA測試，抗LA血清效價(jià)最高達(dá)到8 000、抗LB血清效價(jià)最高達(dá)到30 000。

2．6 最佳包被濃度和抗血清稀釋倍數(shù)的確定

采用棋盤滴定法。包被抗原濃度：1μg·mL－1、2 μg·mL－1、4μg·mL－1、8μg·mL－1，抗血清稀釋倍數(shù)：500、1 000、1 500、2 000、4 000，測定 PBST 空白樣品和0．5μg·mL－1樣品的OD值，結(jié)果見表1。

選擇空白樣品OD值在1．0～1．4之間，且抑制率［抑制率＝（OD空白－OD樣品）／OD空白×100%］最大的包被抗原濃度和抗血清稀釋倍數(shù)組合作為最適條件。由表1可得LA最適工作條件為：包被抗原濃度8μg·mL－1、抗血清稀釋1 000倍；LB最適工作條件為：包被抗原濃度4μg·mL－1、抗血清稀釋1 500倍。

表1 LA和LB的棋盤滴定結(jié)果Tab．1 The result of checkerboard titration of LA and LB

2．7 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

LA和LB標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng·mL－1）：0、10、20、40、80、160、320、640。在最佳包被濃度和最佳抗血清稀釋倍數(shù)下進(jìn)行間接競爭ELISA檢測，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、B／B0為縱坐標(biāo)（B為反應(yīng)OD 值，B0為0ng·mL－1標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)OD 值），用 GraphPad Prism5軟件擬合四參數(shù)Logistic方程得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），LA和LB標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2均大于0．99。經(jīng)10次檢測得到LA的IC50為（92．2±15．1）ng·mL－1，LB的IC50為（258．7±22．5）ng·mL－1。

圖3 LA和LB的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．3 The ELISA standard curves of LA and LB

2．8 最低檢測限測定

重復(fù)檢測10次0ng·mL－1LA和LB標(biāo)準(zhǔn)品，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合計(jì)算測得的濃度，以其均值加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)差（x＋2sd）作為最低檢測限。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LA的最低檢測限為3．9ng·mL－1，LB的最低檢測限為26．1ng·mL－1。

2．9 精密度評(píng)價(jià)

分3批次測定高、中、低濃度LA和LB樣品，每批次各設(shè)10個(gè)復(fù)孔，結(jié)果見表2。

表2 批內(nèi)精密度和批間精密度Tab．2 The intra and inter assay precisions

由表2可以看出：LA檢測方法批內(nèi)精密度CV≤10．7%、批間精密度CV≤11．5%；LB檢測方法批內(nèi)精密度CV≤9．9%、批間精密度CV≤12．3%。

2．10 準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)

分別測定2．9中的高、中、低濃度LA和LB樣品，每個(gè)樣品設(shè)10個(gè)復(fù)孔，計(jì)算回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：LA回收質(zhì)量濃度均值分別為9．2ng·mL－1、110．8 ng·mL－1、244．7ng·mL－1，回收率分別為92．0%、110．8%、87．4%；LB回收質(zhì)量濃度均值分別為44．6 ng·mL－1、131．7ng·mL－1、317．8ng·mL－1，回收率分別為111．5%、109．8%、113．5%。

2．11 交叉反應(yīng)率檢測

采用間接競爭ELISA方法檢測LA和LB的6種結(jié)構(gòu)或功能類似物的IC50，計(jì)算類似物的交叉反應(yīng)率，如表3所示。

表3 交叉反應(yīng)率／%Tab．3 The cross reactivity／%

由表3可以看出，LA與類似物、LB與類似物的交叉反應(yīng)率最大分別為9．20%、3．64%，均不超過10%，表明檢測特異性較好。

2．12 藥物中LA和LB含量測定（表4）

由表4可以看出：LA和LB在4種龍血竭藥物中的最大含量與最小含量分別相差4．05倍和3．57倍；龍血竭總黃酮和膠囊B中2種成分含量均達(dá)到龍血竭藥物的2倍以上，說明龍血竭總黃酮進(jìn)一步濃縮了龍血竭的藥效成分；而膠囊A中LB含量雖然超過膠囊B，但其LA含量在4種藥物中最低。

表4 藥物中LA和LB的含量測定Tab．4 Determination of the contents of LA and LB in the drugs

4種藥物中LB含量均達(dá)到國家藥品標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定（≥0．40%）［14］。用 GraphPad Prism5軟件進(jìn)行2種成分含量相關(guān)性分析得到相關(guān)系數(shù)R為0．12、P＞0．05，說明LA和LB含量不具有顯著相關(guān)性，這可能是由于不同廠家采用的生產(chǎn)工藝或提取方法不同造成的。為更有效地控制龍血竭藥物質(zhì)量，可以在藥品標(biāo)準(zhǔn)中增加對(duì)LA含量測定的要求。

3 結(jié)論

利用溴乙酸在強(qiáng)堿催化下與酚羥基發(fā)生親核取代反應(yīng)生成羧甲基醚作為半抗原，再用碳二亞胺法使其與載體蛋白偶聯(lián)合成人工抗原。建立的LA和LB的酶聯(lián)免疫檢測方法具有較高的精密度、準(zhǔn)確度和特異性，提供了檢測LA和LB的便捷有效方法。

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