張建國,張繼寧,黃勛娟
(1.上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院,上海200093;2.同濟大學環(huán)境科學與工程學院,上海200092)
神經氨酸酶是水解唾液酸(N-乙酰-神經氨酸)與糖蛋白之間糖苷鍵的一種水解酶。根據(jù)糖苷鍵位置的不同可以將神經氨酸酶分為外切酶(E3.2.1.18)和內切酶(E3.2.1.129)。神經氨酸酶廣泛存在于各種微生物中,并有助于微生物在動物體表生存。1947年,神經氨酸酶首先在純培養(yǎng)的霍亂弧菌和產氣莢膜梭菌中被發(fā)現(xiàn)[1],隨后,在其它70多種微生物和病毒中發(fā)現(xiàn)了神經氨酸酶;同時,在原生動物和非致病性的微生物中也發(fā)現(xiàn)了神經氨酸酶。同一種生物中有多種神經氨酸酶,例如粘性放線菌、脆弱擬桿菌、氣腫疽梭菌等中有水解α(2,3)-、α(2,6)-、α(2,8)-鍵的多種神經氨酸酶[2]。哺乳動物中有4種神經氨酸酶 NEU1、NEU2、NEU3、NEU4[3],隨機分布于生物的細胞器中:NEU1、NEU2、NEU3分別存在于溶酶體、細胞質和細胞質膜上;NEU4存在于溶酶體、線粒體和細胞內膜多個細胞器上。
早在1957年就發(fā)現(xiàn)病毒具有水解糖蛋白上糖苷鍵的能力[4]。由于研究手段的限制,1983年才確定神經氨酸酶的晶體結構[5],隨后研究人員利用神經氨酸酶和神經氨酸的復合晶體結構確定了神經氨酸酶的作用機理[6]:神經氨酸酶在水解過程中和糖蛋白形成一個神經氨酸酶陽離子的過渡態(tài),水分子介入后從糖蛋白中釋放出唾液酸[7]。神經氨酸酶在病毒侵染宿主過程中有兩方面的作用:(1)病毒靠近宿主細胞時,病毒表面的神經氨酸酶水解掉宿主細胞表面糖蛋白上的唾液酸殘基,有利于病毒核進入宿主細胞內;(2)子代新病毒利用神經氨酸酶和神經氨酸的相互作用,粘附在宿主細胞表面,等待擴散到周圍的宿主細胞[8]。
圖1 銅綠假單胞菌神經氨酸酶的結構Fig.1 Structure of neuraminidase fromPseudomonas aeruginosa
神經氨酸酶的結構是四聚體,每個單體都含有球形的頭部和細長的頸部(圖1)[9]。流感病毒可以分為A、B、C 3個亞型[10]。神經氨酸酶以頸部固定在病毒的表面,以球形的頭部水解糖蛋白的神經氨酸酶活性部位。分析發(fā)現(xiàn),神經氨酸酶的活性中心是嚴格的保守區(qū)域,由10個極性氨基酸殘基和4個疏水氨基酸殘基組成,含有6個逆時針方向排列的β折疊片。圖2是神經氨酸酶活性中心的示意圖[11]。
圖2 神經氨酸酶活性中心的示意圖Fig.2 The schematic diagram of neuraminidase active center
神經氨酸酶的主要功能是幫助微生物或病毒水解糖蛋白的唾液酸殘基,被廣泛應用于臨床疾病的診斷[2],如治療因神經氨酸酶缺失造成的笨拙綜合癥[1]。神經氨酸酶水解神經節(jié)苷酯的唾液酸殘基,形成含有不同分子數(shù)唾液酸的神經節(jié)苷酯。其中,單唾液酸四己糖神經節(jié)苷酯(GM1)是有效治療腦神經損傷的藥物,目前已得到廣泛應用。
由于化學法制備GM1存在著制備效率低、產品不安全等不足,所以找到高效、安全的GM1制備方法就尤為重要。Peng等[12]報道了一種來源于乳酪短桿菌的神經氨酸酶具有優(yōu)良的性質:專一性水解神經節(jié)苷酯生產GM1,效率高,水解條件溫合,過程簡單。Zhang等[13]將乳酪短桿菌神經氨酸酶基因在大腸桿菌中表達后得到更高的酶活力,為大量制備神經氨酸酶和GM1奠定了基礎。由于神經氨酸酶在病毒侵染宿主過程中的重要作用和神經氨酸酶活性中心保守的特征,神經氨酸酶成為神經氨酸酶抑制劑的主要靶點。
由于神經氨酸酶活性中心是嚴格的保守結構,據(jù)此設計1個與神經氨酸酶活性中心結合的化學分子就是神經氨酸酶抑制劑研究的總體思路[14]。神經氨酸酶活性中心和神經氨酸分子的相互作用已經被解析[6],唾液酸是設計新型神經氨酸酶抑制劑分子的天然模板。2-脫氧-α-唾液酸及其衍生物是最先在病毒神經氨酸酶晶體結構解析后根據(jù)其活性中心分子作用設計的抑制劑。2-脫氧-2,3-雙脫氫-唾液酸(Neu5Ac2en)是經過結構改進之后經體內試驗證實比較有效的1個抑制劑[15],也是后續(xù)新抑制劑的設計模板[8]。經過計算機輔助軟件GRID進一步改進,將Neu5Ac2en的4位羥基替換為氨基或胍基后更契合神經氨酸酶的活性中心,具有更好的抑制效果[16-17],其中4-氨基-4-脫氧 Neu5Ac2en的抑制效果比 Neu5Ac2en的抑制效果高100倍[8]、4-胍基-4-脫氧Neu5Ac2en的抑制效果比Neu5Ac2en的抑制效果高10 000倍[18]。4-胍基-4-脫氧 Neu5Ac2en的抑制效果比4-氨基-4-脫氧Neu5Ac2en的抑制效果更好是由于它除了和Glu119發(fā)生相互作用外,還和Glu229發(fā)生相互作用;此外,這兩種抑制劑對A型和B型病毒均有抑制效果[16]。4-胍基-4-脫氧 Neu5Ac2en被葛蘭素史克命名為zanamivir,zanamivir是第一個被FDA批準銷售的抗病毒藥物,目前在市場上作為吸入式噴霧劑銷售,近年來的研究發(fā)現(xiàn),神經氨酸酶通過變異對zanamivir產生耐藥性[19]。研究表明,唾液酸類抑制劑會保護細胞免受微生物感染引起的炎癥[20-21]。
laninamivir(圖3)是在zanamivir基礎上設計的抑制劑,是將zanamivir的2位3-羥基丙烷基團替換為1-甲氧基-2,3-二羥基丙烷基團形成的。laninamivir比zanamivir和環(huán)己烯類抑制劑oseltamivir具有更長效的抑制效果:zanamivir和oseltamivir需要1d服用2次;而laninamivir只需1d服用1次,且服用后7d內都有很強的抑制效果。laninamivir在日本已經上市,商品名為inavir[22]。
圖3 laninamivir的分子結構Fig.3 Molecular structure of laninamivir
zanamivir的研制成功促使神經氨酸酶抑制劑的母核篩選擴展到更大的范圍。以環(huán)己烯為母核的衍生物比神經氨酸的氧雜環(huán)結構更穩(wěn)定,而且可以在原來氧分子的位置添加多種取代基更好地和神經氨酸酶活性中心相互作用。如將zanamivir的三羥基丙烷基團替換為脂溶性更好的烷基以利于和神經氨酸酶的Glu276發(fā)生作用。以戊烷基作為脂溶性基團的新化合物被命名為oseltamivir[23],在與 Glu276結合時位置會發(fā)生調整,并且,oseltamivir和Arg224形成1個疏水區(qū)域,正好接納疏水性的戊烷基。oseltamivir對A型和B型流感病毒都有抑制效果,IC50值分別為1×10-9mol·L-1和3×10-9mol·L-1[24]。oseltamivir的乙酯形式在1999年被FDA批準作為口服抗病毒藥物由Roche在市場上銷售,商品名為tamiflu。tamiflu在體內被酯酶水解為oseltamivir的活性形式來發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)神經氨酸酶的變異也對oseltamivir產生耐藥性[25]。將oseltamivir 6位碳上的基團替換為含脂肪側鏈后,IC50值降至10-11mol·L-1級別。這是因為,脂肪側鏈的疏水性、側鏈的長度、手性結構對抑制活性有很大影響[24]。將oseltamivir的醚氧基側鏈替換為含氮雜環(huán)后柔性降低[26]、替換為酰胺后極性過大,均導致其不能和酶活性中心很好發(fā)生作用,抑制活性降低[27]。環(huán)己烯母核上的不同位置側鏈環(huán)化形成雙環(huán)化合物,也是由于剛性太強,降低了和酶活性中心的有效相互作用[28]。
peramivir(圖4)是以環(huán)戊烷作為母核的神經氨酸酶抑制劑。它以zanamivir的胍基和oseltamivir的戊烷基作為支鏈,因而可以和Glu227、Glu276相互作用。體外實驗表明peramivir抑制A型和B型病毒的IC50值分別為0.1×10-9~1.4×10-9mol、0.6×10-9~11×10-9mol[29]。BioCryst制藥公司對 peramivir進行Ⅲ期臨床研究發(fā)現(xiàn),雖然它的口服生物利用度差,但可以有效地抑制多種流感病毒。2005年美國FDA批準了peramivir注射劑的臨床試驗。由于peramivir具有zanamivir中4位胍基和oseltamivir中6位大位阻疏水戊烷基,所以神經氨酸酶活性位點的變異很難對peramivir產生耐藥性[30]。
圖4 peramivir的分子結構Fig.4 Molecular structure of peramivir
苯甲酸類神經氨酸酶抑制劑(圖5)的苯環(huán)剛性太強,不能和神經氨酸酶分子的活性中心有效地契合,所以苯甲酸類化合物作為神經氨酸酶抑制劑的活性不高[31]。目前對苯甲酸類神經氨酸酶抑制劑的研究還停留在計算機模擬階段。
圖5 2種苯甲酸類神經氨酸酶抑制劑的分子結構Fig.5 Molecular structure of two analogous of benzoic acid as neuraminidase inhibitor
A-525675(圖6)是含吡咯環(huán)母核的神經氨酸酶抑制劑。也是參照神經氨酸和神經氨酸酶活性中心相互作用而設計的:將相當于zanamivir 5位的N-乙?;鶊F替換為丙烯基后,疏水性更好,有利于和Glu119、Glu227、Asp151發(fā)生相互作用[32]。利用構效定量關系模擬吡咯環(huán)化合物和神經氨酸酶的相互作用,發(fā)現(xiàn)氫鍵和分子間的吸引力(庫侖引力)是主要作用力[33]。目前,A-525675的合成路線也有很多種[34-35]。
圖6 A-525675的分子結構Fig.6 Molecular structure of A-525675
從海洋來源的鏈霉菌中篩選出2種吲哚生物堿類化合物,它們對神經氨酸酶的IC50值分別為67.8×10-6mol·L-1和 122.8×10-6mol·L-1[36]。siastation B是從鏈霉菌中分離到的1種具有神經氨酸酶抑制效果的化合物,進一步鑒定為(3S,4S,5R,6R)-6-乙酰氨基-4,5-雙脫氫哌啶-3-羧酸,該化合物具有廣譜的抑制效果。其合成路線有很多報道[37]。
為了更好地使zanamivir發(fā)揮抑制作用,研究發(fā)現(xiàn)2個zanamivir分子連在一起的抑制效果比zanamivir單體提高100倍[8]。雖然zanamivir二聚體的生物利用度不好,但是在小鼠實驗中表現(xiàn)出更好的抗流感功能。zanamivir二聚體在肺中比zanamivir單體具有更長的保留時間,服用7d后殘留量是zanamivir單體殘留量的100倍。目前這種zanamivir二聚體由日本Sankyo和澳大利亞Biota公司繼續(xù)研發(fā)[38]。
將zanamivir連接到多羥基聚醚鏈載體上形成的多聚體比單體具有更好的抑制效果[39]。Honda等[40]將zanamivir連接到多聚谷氨酸載體上,雖然體外抑制效果變差,但小鼠實驗發(fā)現(xiàn)多聚體有利于小腸的吸收,提高了小鼠的抗病毒能力。
由于病毒的不斷變異,流感病毒對oseltamivir出現(xiàn)耐藥性。DAS181是一種具有神經氨酸酶抑制活性的融合蛋白,它含有粘性放線菌神經氨酸酶活性中心區(qū)域和人表皮錨定蛋白的結合區(qū)域[41],在大腸桿菌中成功融合表達。經過純化后,對多種流感病毒有很強的抑制性[42]。DAS181的商品名為fludase。
Kirchmair等[43]通過計算機模擬篩選出5個對A、B型病毒有很好抑制效果的多環(huán)化合物,它們的IC50值為0.18×10-6~17×10-6mol·L-1,其中artocarpin(圖7)可以明顯抑制3株對oseltamivir敏感的病毒,也可以抑制1株對oseltamivir不敏感的病毒。
圖7 artocarpin的分子結構Fig.7 Molecular structure of artocarpin
利用神經氨酸酶的分子結構和底物的計算機契合、預測,是目前分子藥物開放研究的一個良好平臺,也為抑制劑的臨床試驗奠定了基礎。目前已有2種抗流感藥物投放市場,還有多種抑制劑處于臨床研究階段,神經氨酸酶抑制劑的開發(fā)范圍會越來越廣。
抑制劑和神經氨酸酶活性中心上Glu276的相互作用依然是研究的突破點。神經氨酸酶抑制劑可以和其它種類的抑制劑聯(lián)合作用,例如離子通道抑制劑[44]、三唑核苷[45]或其它抗非病毒藥物[46]。另外,篩選自然界中含有神經氨酸酶抑制劑的微生物也是近年來的研究熱點,為神經氨酸酶抑制劑的開發(fā)提供了更廣闊的空間。
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