吳旭穎，田玉書(shū)，吳金峰，鄭偉斌，王 宇，王飛飛，張文明，楊志偉

(北京華阜康生物科技股份有限公司，北京 102200)

BALB/cA-nu小鼠是Charles River Japan(CRJ)公司通過(guò)對(duì)BALB/cABon-nu和BALB/cAnNCrj-nu進(jìn)行交配和回交得到的品系，1985年CRJ得到了來(lái)源明晰的BALB/cAnNCrj-nu孕鼠，并在同年進(jìn)行剖腹產(chǎn)，此小鼠為近交系，遺傳監(jiān)測(cè)證實(shí)是BALB/c裸鼠，此小鼠胸腺缺失，為第11對(duì)染色體隱性遺傳。由于無(wú)胸腺，僅有胸腺殘跡或異常上皮，不能使T細(xì)胞正常分化，故造成T細(xì)胞缺陷。B淋巴細(xì)胞正常，但功能缺陷，抗體主要為IgM，只有少量IgG，無(wú)接觸敏感性，無(wú)移植排斥反應(yīng)[1]。BALB/cA-nu小鼠作為免疫缺陷動(dòng)物，目前已被廣泛應(yīng)用到腫瘤學(xué)、免疫學(xué)和藥品與生物制品的安全性方面的評(píng)價(jià)以及有效藥品的篩選等實(shí)驗(yàn)方面的研究[2]。BALB/cA-nu小鼠自從國(guó)外引進(jìn)后已經(jīng)超過(guò)20代，隨著飼養(yǎng)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)、繁殖育種以及管理等諸多方面的差異，對(duì)于此小鼠的遺傳、生理生化以及免疫功能等生物學(xué)特性是否發(fā)生改變，尚缺乏了解，還需進(jìn)一步驗(yàn)證和探討，故我們對(duì)本單位5、10周齡的BALB/cA-nu小鼠的主要臟器重量、血液生理生化指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定；同時(shí)為驗(yàn)證其免疫缺陷特性，我們采用流式細(xì)胞儀對(duì)6周齡的BALB/cA-nu小鼠的免疫細(xì)胞做了相關(guān)檢測(cè)，為我國(guó)利用該品系動(dòng)物從事生物醫(yī)藥研究的科研人員提供基礎(chǔ)生物學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源

取SPF級(jí)BALB/cA-nu小鼠5、10周齡各24只，雌、雄比例1∶1，共計(jì)48只，用于臟器重量和血生理生化指標(biāo)檢測(cè)；取6周齡的BALB/cA-nu小鼠4只，雌、雄比例1:1，用于免疫細(xì)胞測(cè)定。所有動(dòng)物均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK(京)2009-0004。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所解剖實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為：SYXK(京)2013-0019。

1.2 飼養(yǎng)管理及環(huán)境

實(shí)驗(yàn)BALB/cA-nu小鼠均飼養(yǎng)在北京華阜康生物科技股份有限公司SPF車(chē)間的隔離器內(nèi)，隔離器內(nèi)的潔凈度為5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，溫度控制在23±3℃，相對(duì)濕度40%～70%，換氣次數(shù)每小時(shí)為20次，明暗照明周期為12 h∶12 h，動(dòng)物自由采食和飲水。

小鼠的飼料為北京華阜康生物科技股份有限公司生產(chǎn)的60Co小鼠繁殖料1315(SCXK(京)2009-0008)。飼料的營(yíng)養(yǎng)成分為：粗蛋白≥23.0%、粗脂肪≥5.0%、粗灰分≤7.0%、粗纖維≤5.0%、水份≤10%、鈣1.4%～1.5%、磷1.0%～1.1%、賴(lài)氨酸≥1.32%、蛋氨酸+胱氨酸≥0.78%水為酸化過(guò)濾自來(lái)水(ph=2.7～3.0)并經(jīng)121℃ 30 min高壓蒸汽滅菌,使用的墊料等物品均經(jīng)過(guò)132℃ 30 min高壓蒸汽滅菌，每周更換1次墊料，進(jìn)出隔離器的物品進(jìn)行嚴(yán)格消毒，嚴(yán)格遵守隔離系統(tǒng)操作規(guī)程。

1.3 儀器及試劑

法國(guó)ABX Pentra DX 120血細(xì)胞分析儀和配套試劑、日立7100全自動(dòng)生化分析儀和配套試劑、美國(guó)貝克曼Allegra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、美國(guó)BD公司流式細(xì)胞儀(FACS)、紅細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 體重和臟器重量的測(cè)定：實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，禁水1 h，用電子天平稱(chēng)取5、10周齡小鼠體重，眼眶采血后脫頸椎處死，立即剖取脾臟、肝臟、腎臟、心臟、肺臟、腦，并用濾紙吸干組織表面的水分，稱(chēng)取重量。

1.4.2 血生理指標(biāo)測(cè)定：從小鼠眼眶后靜脈叢采血，取0.2 mL血液到EDTA2k抗凝管內(nèi)，進(jìn)行血生理測(cè)定。12項(xiàng)血生理指標(biāo)為：血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞(RBC)計(jì)數(shù)、白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞(LYM)、血小板(PLT)、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞體積分布寬度(RDW)。

1.4.3 血生化指標(biāo)測(cè)定：將剩余的全血取0.8 mL到離心管內(nèi)，3000 r/min，離心10 min后取血清，進(jìn)行血生化測(cè)定。15項(xiàng)血清生化指標(biāo)為：總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、白蛋白/球蛋白(A/G)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、總膽紅素(TBIL)、尿素氮(UN)、肌酐(CREA)、無(wú)機(jī)璘(P)、血鈣(Ca)。

1.4.4 免疫功能檢測(cè)方法：采用小鼠摘眼球取血法取300 μL外周血，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后，將細(xì)胞用1% BSA/PBS洗兩次后分為兩管備用。其中一管用PerCP-Cy5.5-CD3、APC-Cy7-CD4、FITC-CD8和PE-Cy7-NK1.1染色30 min，另一管用PerCP-Cy5.5-CD3、FITC-B220和APC-Cy7-CD11b染色30 min，洗后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并用FCS Express V3.0軟件分析數(shù)據(jù)。免疫細(xì)胞測(cè)定：T細(xì)胞(CD3+、CD4+、CD8+)、B細(xì)胞(CD19+、B220+)、NK細(xì)胞(NK1.1+)、粒細(xì)胞(CD11b+)。

1.5 結(jié)果處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示，顯著水平為P< 0.05。

2 結(jié)果

2.1 BALB/cA-nu小鼠臟器測(cè)定結(jié)果

由表1可見(jiàn)，同周齡的BALB/cA-nu小鼠，雄鼠的體重、肝臟和雙腎重量高于雌鼠(P< 0.05)。同性別的BALB/cA-nu小鼠，5周小鼠的肺臟、肝臟、雙腎重量明顯低于10周齡小鼠(P< 0.05)。

表1 BALB/cA-nu小鼠主要臟器重量(單位：g)

2.2 BALB/cA-nu小鼠血生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

由表2可見(jiàn)，同周齡的BALB/cA-nu小鼠,雄鼠HGB、MCH和HCT的值高于雌鼠(P< 0.05)。同性別的BALB/cA-nu小鼠，5周小鼠RDW的值高于10周齡小鼠(P< 0.05)。

2.3 BALB/cA-nu小鼠血生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

由表3可見(jiàn)，同周齡的BALB/cA-nu小鼠，雄鼠TBIL的值高于雌鼠(P< 0.05)。同性別的BALB/cA-nu小鼠，5周小鼠TP、GLOB、CHO、TBIL、UN的值明顯低于10周齡小鼠(P< 0.05)，而5周小鼠A/G的值高于10周齡小鼠(P< 0.05)。

2.4 BALB/cA-nu小鼠免疫細(xì)胞測(cè)定結(jié)果

圖1顯示的是一只BALB/cA-nu小鼠外周血中T細(xì)胞及其亞群、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和粒細(xì)胞的百分比。

由圖2可見(jiàn)，BALB/cA-nu 小鼠外周血無(wú)T細(xì)胞(0.18±0.06)%、CD4+T細(xì)胞(0.26±0.08)%、CD8+T細(xì)胞(0.13±0.04)%,CD19+B細(xì)胞的比例為(30.10±2.74)%、B220+ B細(xì)胞的比例為(30.55±2.77)%，NK細(xì)胞比例為(1.35±0.29)%，粒細(xì)胞比例為(47.90±5.48)%。

表2 BALB/cA-nu小鼠血生理指標(biāo)

表3 BALB/cA-nu小鼠血生化指標(biāo)

圖1 BALB/cA-nu小鼠外周血免疫細(xì)胞百分比

圖2 BALB/cA-nu小鼠免疫細(xì)胞百分比

3 結(jié)論

截止目前，國(guó)內(nèi)報(bào)道有關(guān)BALB/cA-nu小鼠的主要臟器重量，血生理生化指標(biāo)以及免疫細(xì)胞等基本生物學(xué)特性的文獻(xiàn)并不多，而這些指標(biāo)又都是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。臟器重量是鑒定動(dòng)物遺傳品質(zhì)的重要依據(jù)，而血生理生化值又是生物醫(yī)藥研究的基礎(chǔ)指標(biāo)，本研究通過(guò)對(duì)5、10周齡BALB/cA-nu小鼠的主要臟器重量、12項(xiàng)血生理、15項(xiàng)血生化指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，同周齡的BALB/cA-nu小鼠的雌雄相比，體重、肝臟、雙腎重量差異具有顯著性，此結(jié)果與文獻(xiàn)[3]報(bào)道結(jié)果一致，血生理指標(biāo)HGB、MCH差異有顯著性與張修彥的BALB/c小鼠的報(bào)道相一致[4]；同性別小鼠的5周與10周相比，肺臟、肝臟、雙腎差異具有顯著性，TP、GLOB、A/G、CHO、TBIL、UN血生化指標(biāo)差異顯著。

另外，本研究中測(cè)定BALB/cA-nu小鼠的主要臟器，血生理生化的數(shù)據(jù)，通過(guò)與日本SLC公司的1998年的數(shù)據(jù)集中刊登的10周齡的BALB/c Slc-nu/nu小鼠相比，脾臟、WBC、GLU、CREA、TBIL的值稍低，其余各項(xiàng)值很接近[5]；與Charles River公司2011年1月至2012年12月刊登的8～10周齡的BALB/c Nude小鼠相比，血生理很接近，只有血生化中GLU、CREA、TBIL的值偏低[6]。造成此類(lèi)差異的因素，除品系、飼養(yǎng)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)因素外，樣品的采集、貯存處理、儀器、試劑及人員操作等因素的影響也是至關(guān)重要的，尤其是GLU、TBIL分別對(duì)時(shí)間和光照的敏感性，據(jù)趙曉紅報(bào)道[7]血液離體后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，全血中的葡萄糖被分解代謝，血糖濃度逐漸下降，大約每小時(shí)下降5%～7%；血液中的總膽紅素，絕大部分為非結(jié)合膽紅素，血樣在受到光照后，使膽紅素中相當(dāng)部分的非結(jié)合膽紅素形成構(gòu)型異構(gòu)體，繼而進(jìn)一步形成結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，由于結(jié)構(gòu)異構(gòu)體不能參與重氮反應(yīng)，導(dǎo)致測(cè)得TBIL比實(shí)際的值低[8]，但TBIL值偏低，在臨床上無(wú)相對(duì)意義。另外，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食時(shí)間的差異，也對(duì)WBC、CREA、GLU等指標(biāo)有影響[9]。

BALB/cA-nu小鼠作為免疫缺陷動(dòng)物，因其T細(xì)胞特異性免疫缺陷，使其被廣泛地應(yīng)用到免疫學(xué)和藥物研發(fā)研究[10]。機(jī)體的特異性免疫功能分為細(xì)胞免疫和體液免疫，細(xì)胞免疫過(guò)程主要是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的，通過(guò)T淋巴細(xì)胞特異性地識(shí)別抗原，使T細(xì)胞活化、增殖和分化，發(fā)揮免疫效應(yīng)。T細(xì)胞抗原受體(TCR)和CD3+均為T(mén)細(xì)胞膜上的重要分化抗原，是成熟T細(xì)胞的特征性標(biāo)志，T細(xì)胞表面的TCRCD3+構(gòu)成復(fù)合體；CD4+和CD8+是T細(xì)胞表面的糖蛋白，CD4+主要表達(dá)MHCⅡ限制的T細(xì)胞，CD8+主要表達(dá)MHCⅠ限制的T細(xì)胞,CD4+和CD8+作為輔助分子增強(qiáng)T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞(APC)或CTL靶細(xì)胞間的相互作用。CD4+和CD8+的功能與TCR的功能錯(cuò)綜復(fù)雜地聯(lián)系在一起，因此CD4+和CD8+分子通常被視為判斷和鑒定T細(xì)

胞亞群及其成熟的標(biāo)志。B淋巴細(xì)胞是唯一能夠產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，B220+是小鼠全B細(xì)胞最常用標(biāo)記，但這個(gè)標(biāo)記也表達(dá)于活化T細(xì)胞、活化NK細(xì)胞和NK祖細(xì)胞。相對(duì)來(lái)說(shuō)，CD19+是B細(xì)胞較特異的標(biāo)記,主要表達(dá)大多數(shù)B細(xì)胞，從祖B細(xì)胞階段開(kāi)始表達(dá)直至漿細(xì)胞階段[11-13]。因此我們通過(guò)標(biāo)記6周齡BALB/cA-nu小鼠全血中的CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、B220+、NK1.1+、CD11b+抗體基檢測(cè)此小鼠體內(nèi)不同的免疫細(xì)胞情況，結(jié)果表明BALB/cA-nu小鼠表現(xiàn)為T(mén)細(xì)胞免疫缺陷。

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