郝 順，張丹丹，梅文杰，林 嚴，李文娜

(1.遵義醫(yī)學院珠海校區(qū) 藥理學教研室，廣東 珠海 519041；2.廣東藥學院 藥學系，廣東 廣州 510006)

光動力學療法(Photodynamic therapy, PDT)是除手術、放療以及化療之外的又一種治療惡性腫瘤的方法，具有特異性高、無依賴性、毒副作用小以及對正常組織無損傷等特點[1]，現(xiàn)已廣泛應用于臨床。當光敏劑進入患者體內，能動態(tài)地濃集于生長異常的組織，再經(jīng)一定波長的光輻射后，發(fā)生光動力敏化反應產生單線態(tài)氧等活性物質，從而導致生物大分子氧化失活而引起細胞凋亡，達到治療的目的[2]。而光敏劑是PDT中最關鍵的因素，目前應用最廣泛的光敏劑是卟啉類化合物[3]，其作為光敏藥物用于臨床已有20余年歷史，除代表性的血卟啉衍生物(HpD)、原卟啉IX等，人工合成的金屬卟啉化合物也因其具有獨特的結構與生物功能在醫(yī)學研究上取得了較大進展。

本研究將對新合成的6種金屬卟啉化合物的抗腫瘤作用進行細胞水平的篩選，并研究其作用機理，為該類化合物的后繼開發(fā)合成提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 肝癌細胞(HepG2)、肺癌細胞(A549)和乳腺癌細胞(MCF-7)，均由遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)中心實驗室提供。

1.2 藥品與試劑藥品 Rup-03、Rup-04、 HDW-01、HDW-02、HDW-03以及HDW-04均由廣東藥學院梅文杰教授合成并饋贈，藥物結構圖(見圖1)。

圖1 6種藥物的藥物結構圖

其他主要試劑：Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號：130521)；RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco，批號：1279327)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：130902)；胰蛋白酶 (國藥集團，批號：20070719)；MTT(Sigma，批號：2497b516)；SRB(廣州威佳科技有限公司，進口分裝)；Giemsa (天津市天新精細化工開發(fā)中心，批號：20080705)；其余試劑均為分析純。

1.3 主要儀器 超凈工作臺SW-CJ-ZF型(蘇州蘇潔凈化設備有限公司)；CO2培養(yǎng)箱-HF90/HF240型(上海利康瑞生物工程有限公司)；倒置顯微鏡(德國，Leica-351)；Elx-800型全自動酶標儀(德國，Leica)；流式細胞儀CUBE6(德國Partec公司)；全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-RAD公司)；電子分析天平BSA124S(德國Sartorius)；高速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；UV-7501分光光度計(無錫科達儀器廠)。

1.4 細胞培養(yǎng) 將凍存細胞復蘇，接種于含10%小牛血清、1%雙抗(100U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內孵育，待細胞長至80%～90%時傳代培養(yǎng)。

1.5 藥物干預及光動力學處理 按最佳光照及培養(yǎng)時間加藥干預細胞[4]，即取處于對數(shù)增長期的細胞接種在培養(yǎng)板里，細胞密度調整為96孔培養(yǎng)板：4×104～5×104個/mL；24孔培養(yǎng)板：5×104～105個/mL；6孔培養(yǎng)板：1.2×105～2×105個/mL，待細胞生長至90%時加入藥物培養(yǎng)24h，100 W 普通白熾燈光照2 h，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

1.6 SRB法和MTT法測定藥物對細胞增殖的影響 取處理后的細胞，采用SRB和MTT法[5]測定藥物對細胞增殖的影響，并按下公式計算腫瘤細胞的生長抑制率。

1.7 Griess法測定細胞上清液中NO自由基的含量[6]取處理后的細胞上清液100 μL于96孔板，加入等量Griess試劑，輕輕振蕩數(shù)次，待反應液完全混勻后，于540 nm處檢測各孔OD值。以亞硝酸鈉做標準曲線(y=364.3518x-3.2530，R2=0.999 1)，并計算細胞中的NO自由基的濃度。

1.8 Giemsa染色觀察細胞形態(tài) 取處理后的細胞，用甲醇固定細胞10 min 。加入Giemsa染液染色20 min。棄染液，用三蒸水沖去板上多余的染料，空氣中自然干燥。于倒置顯微鏡觀察染色結果。

1.9 流式細胞儀檢測細胞凋亡 按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒方法處理細胞并進行流式細胞儀的觀察和檢測。

1.10 DNA 完整性檢測 根據(jù)試劑盒方法提取腫瘤細胞DNA，應用DNA核酸染料GoldView[7]進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶，拍照記錄。

2 結果

2.1 藥物對細胞增殖的影響 由表1～3可見，6種藥物對各腫瘤細胞的生長均具有一定的抑制作用，各藥的IC50數(shù)值分別為：Rup-03 IC50 = 2.95 × 10-5mol/L， Rup-04 IC50 = 41.59 mol/L，HDW-01 IC50 = 1.26 × 10-6mol/L，HDW-02 IC50 = 6.57 × 10-6mol/L，HDW-03 IC50 = 1.07 × 10-3mol/L和HDW-04 IC50 = 8.21 × 10-5mol/L。

藥物濃度(mol/L)細胞生長抑制率(%)Rup-03Rup-0410-100.45±0.022.39±0.0610-92.04±0.067.12±0.1010-82.26±0.0315.46±0.07**10-76.14±0.04*14.49±0.04**10-639.50±0.10**17.85±0.03**10-540.03±0.03**22.12±0.04**

與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

藥物濃度(mol/L)細胞生長抑制率(%)Rup-01Rup-0210-848.93±0.05**55.38±0.05**10-752.71±0.08**63.11±0.04**10-658.14±0.11**60.63±0.05**10-555.84±0.07**57.31±0.02**10-444.25±0.07**44.34±0.09**

與空白組比較，**P<0.01。

藥物濃度(mol/L)細胞生長抑制率(%)Rup-03Rup-0410-817.85±0.2710.56±0.1210-726.78±0.13*28.78±0.10**10-632.24±0.11**33.15±0.04**10-536.43±0.10**37.52±0.07**10-443.35±0.04**49.92±0.19**

與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 藥物對HepG2細胞上清液中NO自由基含量的影響 由圖2可以見隨藥物濃度增加，細胞上清液中NO的量隨之增多，呈濃度-效應關系。

與各組空白組比較#P<0.01。圖2 Rup-03和Rup-04對HepG2細胞NO含量變化的影響

2.3 Giemsa染色法觀察Rup-03對HepG2細胞形態(tài)的影響 采用Giemsa法觀察Rup-03(10-10～10-5mol/L)對HepG2細胞的影響，如圖3A可見，光鏡下為加藥的HepG2細胞呈梭形或多邊形生長，細胞大小均一、輪廓清晰。給藥后，細胞形態(tài)開始發(fā)生變化，細胞間接觸消失，與鄰近細胞產生分離(見圖3B、C、D)，且隨著藥物濃度的增加，細胞凋亡情況越加嚴重，細胞核固縮變圓，細胞邊緣出現(xiàn)了皺褶和卷曲(見圖3E、F)，進而細胞破裂，染色質溢出，死亡細胞較多(見圖3 G)。

A：未用Rup-03處理的HepG2細胞；B-G：Rup-03為10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L時的細胞形態(tài)。 圖3 Giemsa染色觀察Rup-03對HepG2細胞形態(tài)的影響(×250)

2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 AnnexinV-FITC/PI雙染色后，流式細胞儀分析結果見圖4，Q2象限表示AnnexinV(+)/PI(+)的晚期凋亡細胞以及壞死細胞，Q3象限表示AnnexinV(+)/PI(-)的早期凋亡細胞(通常AnnexinV陽性群表示凋亡細胞，因此用象限Q2+Q3的值表示細胞凋亡率)，由圖4可見隨著藥物濃度從10-9mol/L增加到10-6mol/L，細胞凋亡率由15.15%上升到83.20%。

注：A：未用Rup-03處理的HepG2細胞凋亡情況；B-E：Rup-03為10-9、10-8、10-7、10-6mol/L時HepG2細胞凋亡情況。 圖4 流式細胞儀觀察Rup-03誘導HepG2細胞的凋亡

2.5 DNA完整性檢測 由圖5可見未加入Rup-03的HepG2細胞的DNA凝膠電泳為單一明亮條帶，當Rup-03濃度為10-9mol/L時與未用藥物處理的細胞條帶相差不大，但當濃度大于10-8mol/L時，DNA條帶已變化為涂布狀，且條帶亮度越來越暗。

A：未用藥物處理的HepG2細胞；B-E：Rup-03為10-9、10-8、10-7、10-6mol/L時HepG2細胞DNA條帶。圖5 Rup-03對HepG2細胞DNA凝膠電泳的影響

3 討論

金屬卟啉化合物對一些組織具有特殊的親和力，將其注入腫瘤患者體內，能聚集在病變部位，再利用卟啉化合物具有特殊的電子吸收和熒光吸收的特征將病變部位與機體的其他部位相區(qū)分，就可以確定腫瘤的準確部位[8]。此外，這類化合物還具有良好的光化學性質，當其選擇性濃集于腫瘤靶部位時，在氧的存在下，用某種波段的光或激光照射病灶，化合物可以吸收能量并激發(fā)出單線態(tài)氧(1O2)等自由基殺死腫瘤細胞從而達到治療效果。

SRB法和MTT法測定結果表明，Rup-03、Rup-04、HDW-03和HDW-04對實驗用瘤株生長的抑制作用具有濃度依賴性，但HDW-01、HDW-02對A549細胞生長抑制作用卻隨濃度增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。觀察細胞對藥物作用的敏感性，HDW-01和HDW-02作用A549細胞時，細胞生長抑制率總體波動不到20%，細胞對藥物濃度變化所產生的反應不顯著，且濃度升高，細胞生長抑制率反而降低；HDW-03和HDW-04作用于MCF-7細胞時，盡管最低濃度和最高濃度的生長抑制率相差較大，但濃度越高，其對細胞的生長抑制率作用變化浮動范圍越小，細胞對藥物的反應性也相應減弱。因此我們選定Rup-03和Rup-04檢測對HepG2細胞中NO含量的影響。

NO屬于活性氮自由基，高濃度的NO具有促凋亡的作用[9]，若細胞凋亡程度較高，則細胞內NO的含量也相應較高。由圖2可以看出Rup-03誘導細胞內NO生成的效果要優(yōu)于Rup-04，此作用與HepG2細胞生長抑制率的結果一致，因此選Rup-03進行Giemsa染色來觀察細胞形態(tài)學的變化。

細胞凋亡時細胞的形態(tài)變化將經(jīng)歷三個過程[10-11]：首先是凋亡開始，可觀察到細胞變圓、細胞間接觸消失以及與鄰近細胞分離，核內染色質會縮聚到核膜的邊緣，呈塊或碎裂狀變化；其次是凋亡小體(apoptotic body)的形成；最后，巨噬細胞或鄰近的細胞將吞噬凋亡小體。本實驗中，Giemsa染色結果觀察到加入了藥物Rup-03的HepG2細胞發(fā)生了凋亡，細胞的形態(tài)從大小均一、清晰完整變化至細胞核固縮變圓、細胞生長密度下降、活細胞數(shù)減少，且隨著藥物濃度的增加凋亡情況越顯著。當濃度為10-10mol/L時，所有腫瘤細胞的形態(tài)與正常細胞形態(tài)相似，無明顯變化，這表明10-10mol/L這一濃度對細胞殺傷作用較弱，當藥物濃度為10-5mol/L時，大量細胞脫壁，細胞碎裂狀現(xiàn)象嚴重，具有完整細胞核的細胞數(shù)目不足一半(見圖3G)，說明受損傷的細胞較多。因此選定10-9～10-6mol/L濃度范圍的Rup-03做進一步的機理研究。

細胞凋亡早期，細胞膜內的磷脂酰絲氨(Phosphatidylserine，PS)會從細胞膜內側翻轉到了細胞膜外側，而這一變化可通過Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒來檢測。當細胞凋亡時胞漿內的Ca2+、Mg2+升高，激活核酸內切酶將導致180～200 bp及其倍數(shù)的小DNA片段出現(xiàn)，這是細胞凋亡時最主要的生化特征。流式細胞儀和DNA完整性檢測的結果都表明隨著Rup-03濃度的升高，細胞凋亡現(xiàn)象越來越明顯，在10-6mol/L濃度時達到最高峰。

本實驗結果顯示6種新型卟啉化合物對腫瘤細胞都具有一定的殺傷作用，效果最好的藥物是Rup-03，最適藥物濃度為10-9～10-6mol/L，其機制可能是通過自由基途徑誘導細胞凋亡。本文僅從細胞凋亡角度研究了新型金屬卟啉化合物的抗腫瘤作用，要完全闡明藥物的作用機理，還需更多的實驗探索。

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