索志榮等

摘 要：目的：建立測(cè)定杞菊地黃丸中沒食子酸的高效液相色譜電化學(xué)分析方法，并用該方法測(cè)定杞菊地黃丸。方法：采用反相高效液相色譜電化學(xué)檢測(cè)法，以Zorbax SB-C18（150mm×4.6mm，5.0？滋m）為色譜柱；甲醇-2%醋酸為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為1.0mL·min-1；檢測(cè)電壓為0.7V，柱溫為30℃。結(jié)果：沒食子酸濃度在15.81-41.73μg·mL-1（r=0.9992）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率（n=3）分別為98.1%（RSD=1.6%）。結(jié)論：方法快速，準(zhǔn)確，可用于杞菊地黃丸的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；電化學(xué)檢測(cè)；杞菊地黃丸；沒食子酸

杞菊地黃丸（濃縮丸）由枸杞子、菊花、熟地黃、山茱萸（酒制）、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉八味藥組成，具有滋腎養(yǎng)肝的功效，主要用于肝腎陰虧、眩暈耳鳴、羞明畏光、迎風(fēng)流淚、視物昏花等癥。其主要成分山茱萸中含有沒食子酸[1]，且研究表明沒食子酸具有良好的抗氧化性能[2]。目前，對(duì)酚酸類化合物沒食子酸的分離檢測(cè)方法有薄層色譜法[3]，毛細(xì)管電泳法[4]，高相液相色譜法[5]，紫外分光光度法[6]等。但對(duì)杞菊地黃丸中沒食子酸的檢測(cè)未見報(bào)道。文章基于電化學(xué)檢測(cè)器靈敏度高、選擇性好等特性[7]，采用高效液相色譜電化學(xué)檢測(cè)（HPLC-ECD）法，對(duì)杞菊地黃丸中沒食子酸進(jìn)行了分離和測(cè)定。為評(píng)價(jià)和控制杞菊地黃丸的質(zhì)量提供了依據(jù)。

1 試劑與儀器

試劑：沒食子酸對(duì)照品（購(gòu)自sigma公司），純度為99.7%；甲醇為色譜純；醋酸為分析純；水為超純水；杞菊地黃丸：蕪湖張恒春藥業(yè)有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字Z34020128，批號(hào)：1306131、1208091）。

儀器：Agilent1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；UPH型優(yōu)普系列超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）；KQ5200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

2 溶液配制

2.1 供試品溶液

取杞菊地黃丸40丸，在研缽中研細(xì)，過(guò)6號(hào)篩后，得到杞菊地黃丸粉末樣品。取杞菊地黃丸粉末2g，精確稱量，置于10mL試管中，加入適量甲醇，超聲提取2次，每次15min，濾入25mL容量瓶中，再用甲醇定容至刻度，搖勻。取適量用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得杞菊地黃丸供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液

精密稱取沒食子酸對(duì)照品5.24mg于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，配得沒食子酸濃度為0.21mg·mL-1的對(duì)照品溶液，作為儲(chǔ)備液，其它不同濃度的對(duì)照品溶液由儲(chǔ)備液稀釋得到。

3 色譜條件

ZorbaxSB-C18（150mm×4.6mm，5.0？滋m）色譜柱（美國(guó)）；流動(dòng)相：甲醇-2%醋酸，梯度洗脫，其時(shí)間程序?yàn)?→30→32→37→40→50min，甲醇體積分?jǐn)?shù)相應(yīng)為5.0%→35.0%→90.0%→90.0%→5.0%→5.0%，流速：1.0mL·min-1；電化學(xué)檢測(cè)器：安培檢測(cè)，電壓0.7V，柱溫：30℃。沒食子酸的保留時(shí)間為3.530min。色譜圖見圖1。

4 方法學(xué)考察與樣品分析

4.1 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2”項(xiàng)所配的沒食子酸儲(chǔ)備液一定體積于量瓶中，用甲醇稀釋，配成沒食子酸濃度分別為4.2，8.4，16.8，25.2，33.6，42.0μg·mL-1的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10.0μL進(jìn)行測(cè)定，以平均峰面積Y（mAu·s）對(duì)濃度C（μg·mL-1）進(jìn)行線性回歸，沒食子酸回歸方程和相關(guān)系數(shù)為：Y=3353.26C-52023.86（r=0.9992）。

4.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取杞菊地黃丸（批號(hào)：1306131）的供試品溶液10.0μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行測(cè)定，原兒茶酸峰面積積分值的RSD為1.4%。

4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱量杞菊地黃丸（批號(hào)：1306131）粉末約2g共6份，按“2.1”項(xiàng)操作制備供試品溶液后，進(jìn)行測(cè)定，沒食子酸含量的RSD為2.9%。

4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)杞菊地黃丸（批號(hào)：1306131）的供試品溶液在8h之內(nèi)每隔1h進(jìn)行考察，結(jié)果沒食子酸峰面積積分值的RSD為1.8%（n=9）。

4.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱量杞菊地黃丸（批號(hào)：1306131）粉末約1.0g，共3份，每份分別準(zhǔn)確加入1.0mL沒食子酸儲(chǔ)備液，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液后，進(jìn)行測(cè)定。沒食子酸的平均加樣回收率（n=3）為98.7%；RSD為2.3%。

4.6 樣品分析

按“2.1”項(xiàng)下操作制備供試品溶液，在“3”項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)樣10.0μL，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法以峰面積計(jì)算含量。結(jié)果批號(hào)1306131和1208091中沒食子酸含量分別為0.268mg·g-1和0.273mg·g-1。

5 討論

5.1 提取條件的選擇

分別考察了水，20%甲醇，40%甲醇，60%甲醇，80%甲醇及甲醇對(duì)提取效率的影響。結(jié)果顯示：用甲醇作為溶劑提取時(shí)，沒食子酸的提取率最高。

5.2 工作電壓的選擇

以對(duì)照品儲(chǔ)備液配制一定濃度的沒食子酸待測(cè)液，在“3”項(xiàng)條件下，進(jìn)樣7.0μL，考察檢測(cè)電位范圍為：0.1-0.9V。以沒食子酸在ECD上的響應(yīng)峰面積對(duì)電極的工作電壓作圖，得到其流體動(dòng)力學(xué)伏安圖，如圖2。由圖可以看出：當(dāng)電位高于0.7V時(shí)，沒食子酸的電化學(xué)響應(yīng)出現(xiàn)一個(gè)平臺(tái)，繼續(xù)提高電位，雖然峰電流繼續(xù)增加，但噪音也明顯增加。故選擇檢測(cè)電位為0.7V（vs.Ag/AgCl）。

5.3 色譜條件的優(yōu)化

先后嘗試了不同比例的甲醇-醋酸作為流動(dòng)相的等度洗脫以及各種梯度洗脫，對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：不加醋酸或醋酸濃度較低時(shí)，色譜峰出現(xiàn)不同程度的拖尾，加入醋酸后隨著濃度的增加色譜峰的對(duì)稱性增加，且保留時(shí)間變化不大，同時(shí)考慮到色譜柱的耐酸范圍，故選0.2%醋酸溶液作為一相洗脫液；為得到較好的分離效果，采用梯度洗脫方式。經(jīng)試驗(yàn)，色譜條件為：流動(dòng)相為甲醇-2%醋酸，梯度洗脫，時(shí)間程序?yàn)?→30→32→37→40→50min，甲醇體積分?jǐn)?shù)相應(yīng)為5.0%→35.0%→90.0%→90.0%→5.0%→5.0%，色譜分離效果較好。

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作者簡(jiǎn)介：索志榮，副教授，從事藥物分析研究。