胡 婷,谷 潔,2,*,甄麗莎,3,楊 玖,史龍翔,王小娟,高 華,2

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院, 楊凌 712100；2. 陜西省循環(huán)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心, 楊凌 712100；3. 陜西省微生物研究所, 西安 710043)

石油污染土壤中苯酚降解菌ad049的鑒定及降解特性

胡 婷1,谷 潔1,2,*,甄麗莎1,3,楊 玖1,史龍翔1,王小娟1,高 華1,2

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院, 楊凌 712100；2. 陜西省循環(huán)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心, 楊凌 712100；3. 陜西省微生物研究所, 西安 710043)

以苯酚為唯一碳源,采用富集培養(yǎng)方法,從陜北靖邊油田污染土壤中分離獲得1株苯酚高效降解菌(ad049),對菌株進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化檢驗(yàn)及 16S rDNA 序列分析,確定該菌株為紅球菌(Rhodococcus)。采用搖瓶振蕩培養(yǎng)方法,研究了接種量、pH 值、溫度和底物濃度對 ad049 生長量和苯酚降解率的影響,同時對該菌株脫氫酶和鄰苯二酚雙加氧酶活性進(jìn)行了測定。結(jié)果表明,ad049 具有較強(qiáng)的苯酚降解能力；在苯酚濃度1000 mg/L,溫度 35 ℃,pH 值8,接種量 5% 的培養(yǎng)條件下,反應(yīng)24 h后,苯酚降解率達(dá) 99%以上,且整個降解過程符合零級動力學(xué)方程,速率常數(shù)k0=41.51,相關(guān)系數(shù)R2=0.96。通過鄰苯二酚雙加氧酶活性的測定,推測出該菌株降解苯酚的途徑可能是以鄰苯二酚 1,2 雙加氧酶為主要途徑進(jìn)行鄰位開環(huán),輔以鄰苯二酚 2,3雙加氧酶進(jìn)行間位開環(huán)。

石油污染土壤；苯酚；生物降解；紅球菌

苯酚是燃料、農(nóng)藥、醫(yī)藥、造紙等行業(yè)的重要生產(chǎn)原料,也是多種人工合成物如殺蟲劑生物降解過程中產(chǎn)生的一種中間代謝產(chǎn)物,是工業(yè)廢水中主要的污染物之一。苯酚由于其嚴(yán)重的危害性已被美國環(huán)保署列入優(yōu)先污染物和 65 種有毒污染物名單,我國也把苯酚列入中國環(huán)境優(yōu)先污染物名單[1- 3]。大量的苯酚及其衍生物在水體和土壤中排放,污染了水體和土壤,對農(nóng)作物造成危害,導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境日趨惡化,甚至嚴(yán)重威脅到人類的身體健康,影響社會的可持續(xù)發(fā)展。利用微生物降解苯酚的方法具有對環(huán)境友好,成本低廉等優(yōu)點(diǎn),已成為修復(fù)苯酚污染環(huán)境的最有效途徑,高效降解菌的篩選是微生物修復(fù)苯酚污染環(huán)境的關(guān)鍵[4]。

目前,國內(nèi)外已從各種受苯酚污染的環(huán)境中分離出參與降解苯酚的微生物有假單胞菌(Pseudomonassp.)[5- 6],芽孢桿菌(Bacillussp.)[7],微球菌(Micrococcussp.)[8- 9],醋桿菌(Acetobactersp.)[10],節(jié)桿菌(Arthrobacteriumsp.)[11],克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)[12],叢毛單胞菌(Comamonassp.)[13- 14]等。Gennaro 等[15]分離出1株混濁紅球菌 R7 (RhodoccocusopacusR7),可以分別通過龍膽酸途徑和鄰苯二酚途徑降解萘和二甲苯,該菌株的發(fā)現(xiàn)使得人們對紅球菌降解芳烴的理論有了進(jìn)一步的研究。沈錫輝等[16]分離到1株既能降解苯酚又能降解萘及其它多種芳烴的紅球菌 PNAN5 菌株(Rhodoccocussp. Strain PNAN5),苯酚濃度在 2—10 mmol/L 范圍內(nèi)、溫度 20—40 ℃、pH 7.0—9.0,菌株 PNAN5 降解苯酚的效率保持在 80%—100% 之間[17]。本研究以采自陜北靖邊的石油污染土壤作為土樣,由于石油中的芳香烴類物質(zhì)比較難降解,所以依次選取單環(huán)到多環(huán)芳烴類物質(zhì)模擬石油污染提供碳源篩選菌株,獲得了1株既可高效降解苯酚,又可降解鄰苯二酚和間苯二酚等酚類化合物的菌株 ad049,對其進(jìn)行形態(tài)特征觀察,生理生化檢驗(yàn)和 16S rDNA 序列分析鑒定,確定其為紅球菌。本文測定了菌株 ad049 的脫氫酶和鄰苯二酚雙加氧酶活性,研究了接種量、pH 值、溫度和不同初始苯酚濃度對菌株生長量和苯酚降解率的影響,并且對菌株降解苯酚的過程進(jìn)行了動力學(xué)分析,以期為微生物修復(fù)苯酚污染環(huán)境提供技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種來源

本課題組用五點(diǎn)法采集陜北靖邊油田污染土壤中 0—20 cm 的土樣,經(jīng)過分離篩選,獲得1株苯酚高效降解菌株命名為 ad049,供后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)LB 液體培養(yǎng)基(g/L)：去離子水 1 L,酵母膏 3 g,蛋白胨 10 g,NaCl 5 g,pH 值 7.0—7.2。

(2)LB 固體培養(yǎng)基：LB 液體培養(yǎng)基中加入瓊脂 15—20 g/L。

(3)苯酚無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基(g/L)：NH4Cl 1.1 g,K2HPO41 g,NaCl 0.5 g,KCl 0.2 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,FeSO40.001 g,CaCl20.01 g,pH 值 7—8。微量元素 1 mL,苯酚按實(shí)驗(yàn)需要量添加,蒸餾水定容至1 L。

微量元素溶液：H3BO30.057 g,MnSO4·7H2O 0.043 g,ZnSO4·7H2O 0.043 g,CuSO4·5H2O 0.04 g, (NH4)6Mo7O24·4H2O 0.037 g,蒸餾水定容至 1 L。

以上培養(yǎng)基均在 121 ℃ 高壓蒸汽滅菌 30 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株 ad049 的生理生化及 16S rDNA 鑒定

菌株 ad049 的生理生化鑒定參考文獻(xiàn)[18]進(jìn)行。

菌株 ad049 的 16S rDNA 序列分析參考文獻(xiàn)[19]進(jìn)行。采用細(xì)菌通用引物 F27 (5′-GAGTTTG ATCATGGCTCAG-3′) 及 R1492(5′-GGTTACCTTG TTACGATC-3′) 進(jìn)行擴(kuò)增。16S rDNA 測序工作由華大基因完成。將 16S rDNA 序列通過 Blast (http://www.ncbi. nlm.nib.gov /blast /blast.cgi) 進(jìn)行相似序列搜索,根據(jù)最相似序列確定其系統(tǒng)發(fā)育地位。用 C1ust X 對序列進(jìn)行對位排序, MEGA4.1 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) 計(jì)算遺傳距離,鄰結(jié)法(Neighbor-joining) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖。

1.2.2 苯酚含量的測定

采用 4-氨基安替比林直接分光光度法測定苯酚含量[20]。

1.2.3 菌株 ad049生長曲線的測定

按 1% 的接種量將菌懸液接入 LB 液體培養(yǎng)基中 35 ℃,180 r/min 振蕩培養(yǎng),每 2 h 取一次樣,用分光光度計(jì)于 600 nm 處測定光吸收值(OD600),試驗(yàn)做 3 個重復(fù)。以O(shè)D600表示該菌株的生長量(下同)。

1.2.4 菌株 ad049 降解特性的研究

將菌株 ad049接種在 LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 16 h(35℃、180 r/min)后,用 0.85% 的無菌生理鹽水稀釋至OD600=0.1制成菌懸液,接種于含有1000 mg/L 苯酚的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中,按設(shè)定的接種量、pH(用 1 mol/L HCl或 1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié))、溫度和初始苯酚濃度進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)。24 h后,測定OD600和培養(yǎng)基中苯酚的剩余含量,計(jì)算苯酚的降解率,試驗(yàn)做 3 次重復(fù)。

1.2.5 菌株 ad049 酶活性的測定

(1) 脫氫酶活性測定

將菌液于10000 r/min離心5 min,棄去上清液,收集菌體細(xì)胞,用生理鹽水反復(fù)沖洗 3 次,用蒸餾水配成菌體濕重為15 g/L的細(xì)胞懸浮液。具體測定方法參考文獻(xiàn)[21]。

(2) 鄰苯二酚雙加氧酶活性的測定

將菌液于 10000 r/min 離心 30 min,上清液用來測胞外酶活性。

將菌液于 10000 r/min 離心 15 min 收集菌體,以 pH 為 8.0 的 50 mmol/L 磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞 2 次,然后懸浮在相同的緩沖液中超聲處理,10000 r/min離心 1 h,其上清液即為細(xì)胞裂解液,用于胞內(nèi)酶活性測定[16]。

C12O 和 C23O 的胞內(nèi)酶活性參考文獻(xiàn)[22]進(jìn)行測定。一個酶單位(U) 定義為 3 mL 測定體積中 1 min 內(nèi)催化產(chǎn)生 1 μmol 粘糠酸和 2-羥基粘糠酸所需的酶量(μmol·L-1·min-1)。

1.2.6 菌株 ad049 降解苯酚的動力學(xué)分析

按 5% 的接種量將菌株 ad049 分別接種于苯酚濃度為 500、1000 和 1500 mg/L 的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,每隔 4 h 測定苯酚剩余含量,構(gòu)建菌株 ad049 降解苯酚的動力學(xué)模型,試驗(yàn)做 3 個重復(fù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株 ad049 生理生化特征及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

以苯酚為唯一碳源,采用富集、馴化培養(yǎng)方法,從陜北靖邊油田污染土壤中分離得到一株苯酚降解菌株,命名為 ad049。該菌株在 LB 培養(yǎng)基上生長時為規(guī)則的圓形,邊緣整齊,表面凸起,易挑起,菌落顏色呈粉紅色,革蘭氏陽性。對菌株 ad049 進(jìn)行生理生化鑒定,其生理生化特征與嗜吡啶紅球菌(Rhodococcuspyridinivoran)[23]不完全一致(表 1)。

將菌株 ad049 的 16S rDNA 測序結(jié)果提交到 NCBI上進(jìn)行 BLAST,其核苷酸的序列同源性分析結(jié)果表明ad049 和紅球菌屬(Rhodococcus)親緣關(guān)系最近并聚為一簇,其同源性高達(dá) 100%,與 Genbank 發(fā)布的嗜吡啶紅球菌序列的相似度達(dá)到 98%(圖 1)。綜合以上生理生化鑒定特征及 16S rDNA 基因序列同源性鑒定該菌株為紅球菌屬。

表1 菌株 ad049 的生理生化鑒定特征

+：陽性； -：陰性

2.2 菌株 ad049 的常規(guī)生長曲線

如圖 2,測定了 ad049 在 LB 液體培養(yǎng)基中 72 h 內(nèi)的生長量,結(jié)果表明,在培養(yǎng)前 14 h,菌株呈對數(shù)生長,14—68 h 之間進(jìn)入生長穩(wěn)定期,從 68 h 開始進(jìn)入衰亡期。菌株生長進(jìn)入穩(wěn)定期活性最高,并可相對持續(xù)一定時間,因此,后期試驗(yàn)采用培養(yǎng) 16 h 的菌液。

2.3 菌株 ad049 降解特性的研究

2.3.1 接種量對 ad049 生長量和苯酚降解率的影響

接種量對處理體系處理效果及處理效率有直接的影響。按 1%、3%、5%、7%、9%、11%、13% 的接種量將菌懸液接入 1000 mg/L、pH=8 的苯酚無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中,35 ℃,180 r/min 培養(yǎng)。如圖 3,接種量在 1%—5% 之間,菌株 ad049 的生長量和苯酚降解率均隨接種量的增加而快速增大,OD600值從 0.49 增大到 1.97,苯酚降解率從 28.21% 增大到 98.75%；在接種量大于 5% 時,菌的生長量和苯酚降解率基本穩(wěn)定。這是由于接種量過小,菌數(shù)量少,不能充分利用營養(yǎng)物質(zhì)和苯酚,使得苯酚降解率偏低；增大接種量,菌有足夠可以利用的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長,因而菌對苯酚的降解率隨之升高。結(jié)果表明,適當(dāng)?shù)脑黾咏臃N量有利于快速去除苯酚。

圖1 ad049 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of ad049括號內(nèi)為Genbank登錄號；分支點(diǎn)上的數(shù)字為自展值百分比；線段0.005為核苷酸替換率

圖2 ad 049 的生長曲線Fig.2 Growth curve of ad049

圖3 不同接種量對 ad049 生長量和苯酚降解率的影響Fig.3 Effect of inoculums on the growth and phenol degradation of ad049

2.3.2 pH 對 ad049 生長量和苯酚降解率的影響

按 5% 的接種量將菌株 ad049 接種于初始苯酚濃度為 1000 mg/L 的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)

基中,調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的 pH 分別為 4、5、6、7、8、9、10、11 和 12,35 ℃,180 r/min 培養(yǎng),來研究 pH 對菌株的生長量和苯酚降解率的影響。如圖 4,在初始 pH < 8 時,菌株 ad049 的生長量和苯酚降解率隨 pH 值的增大而增大；在 pH=8 時,菌株的生長量(OD600=1.82)和苯酚降解率(99.83%)都達(dá)到了最大,但是與 pH 值為 9、10、11 沒有顯著性的差異(P>0.05)。當(dāng) pH >11 時,隨著 pH 值的增大,菌株 ad049 的生長量和苯酚降解率迅速下降。結(jié)果表明稍偏堿性的環(huán)境更利于菌株 ad049 的生長,其最佳生長和降解苯酚的 pH 為 8。有研究表明,苯酚對微生物的毒性作用隨 pH 值的增大而減小,這是由于苯酚在水溶液中為酸性 (pH=5.2),堿性環(huán)境降低了苯酚本身的毒性從而加快了微生物的新陳代謝[24]。在偏酸或偏堿的條件下,pH 可能通過影響苯酚的離子化程度和苯酚降解過程中相關(guān)酶的活性, 使得微生物對苯酚的利用能力下降,從而抑制了微生物對苯酚的降解。劉興平[25]研究表明,pH 對苯酚的化學(xué)毒性有明顯影響,當(dāng) pH 較低時,苯酚可能以化合態(tài)存在,pH 較高時,以游離態(tài)存在,更易于苯酚的降解。

圖4 不同 pH 對 ad049 生長量和苯酚降解率的影響Fig.4 Effect of pH on the growth and phenol degradation of ad049

2.3.3 溫度對 ad049 生長量和苯酚降解率的影響

圖5 不同溫度對 ad049生長量和苯酚降解率的影響Fig.5 Effect of temperature on the growth and phenol degradation of ad049

按 5% 的接種量將菌株 ad049 接種于初始苯酚濃度為 1000 mg/L、pH=8 的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中,調(diào)節(jié)溫度分別為 25、30、35、40、45 ℃,180 r/min 培養(yǎng)來研究溫度對菌株的生長量和苯酚降解率的影響。結(jié)果如圖 5,菌株 ad049 的生長量和苯酚降解率是一致的。25—35 ℃,菌株 ad049 的苯酚降解率以及生長量(OD600值)隨溫度的升高而增加,35—40 ℃ 比較適合菌株的生長,菌株在該溫度范圍內(nèi)OD600值達(dá)到了 1.8 以上,其中 35 ℃ 菌株 ad049 的苯酚降解率最高達(dá)到了 99.29%。繼續(xù)升高溫度,高溫使得菌中降解苯酚的相關(guān)酶活性降低甚至失去,菌株 ad049 的生長量和苯酚降解率迅速減小。溫度的變化直接影響酶促反應(yīng)速率,從而影響細(xì)胞內(nèi)部的物質(zhì)合成及對苯酚的降解。因此,35—40 ℃ 比較適合菌的生長以及對苯酚的降解。

2.3.4 苯酚濃度對 ad049 生長量和苯酚降解率的影響

配制苯酚濃度為 500、750、1000、1250、1500 mg/L 的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基,pH=8。按5% 的接種量將菌懸液接入 50 ml 上述無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中,35 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)。如圖 6,菌株 ad049 在苯酚濃度為 500—1500 mg/L 的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中均能良好的生長,并且苯酚濃度越大,菌的延滯期越長。培養(yǎng) 8 h 后,菌株 ad049 在苯酚濃度為 500 mg/L 的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中OD600達(dá)到了 1.16,而 750、1000、1250、1500 mg/L 苯酚濃度菌株的OD600分別為 0.44、0.34、0.26、0.08。培養(yǎng) 24 h 以后,1000 mg/L 和 1250 mg/L 苯酚濃度菌株的OD600分別為 1.73 和 1.33,而 1500 mg/L 的OD600為 0.69。苯酚濃度為 1500 mg/L 的培養(yǎng)基中菌株生長的比較緩慢。這是由于一方面苯酚為菌株的生長提供唯一碳源,如果濃度太低,菌株不能獲得充足營養(yǎng),其生長將會受到抑制,另一方面苯酚的毒性較大,濃度超過一定值時就會對菌株的生長造成危害,抑制其生長。結(jié)果表明,1000 mg/L 的苯酚濃度比較適合該菌株的生長。

圖6 不同苯酚濃度對 ad049生長量的影響Fig.6 Effect of phenol concentration on the growth of ad049

圖7 不同苯酚濃度對 ad049 苯酚降解率的影響Fig.7 Effect of phenol concentration on the phenol degradation of ad04

由圖 7 可知,菌株 ad049 在苯酚濃度為 500—1500 mg/L 的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中均能良好的生長,利用降解苯酚。培養(yǎng) 12 h 后,500 mg/L 苯酚濃度的降解率達(dá)到了 99.79%,而 750、1000、1250、1500 mg/L 苯酚濃度的降解率分別為 68.88%、35.43%、20.83%、13.45%。其中 750、1000、1250 mg/L 苯酚濃度的降解率達(dá)到 95% 以上分別需要 20、24、36 h,而 1500 mg/L 苯酚濃度培養(yǎng) 44 h 后苯酚降解率只達(dá)到了 91.92%。 由圖 6 和圖 7 可以看出隨著培養(yǎng)時間延長,菌株的生長量增大,菌株的苯酚降解率也增大,菌株的生長量和苯酚降解率表現(xiàn)出很好的一致性。以上結(jié)果說明,苯酚對該菌有一定的毒害抑制作用,1000 mg/L 最適合菌株的生長和對苯酚的降解,高濃度時苯酚抑制菌體的生長和繁殖,影響菌體對苯酚的降解。另外,在高濃度的條件下,延長培養(yǎng)時間會有效提高苯酚降解效率。晁群芳等[26]從烏魯木齊煉油廠活性污泥中分離出1株苯酚降解菌,在其最佳條件下,苯酚濃度為 300—500 mg/L 時降解良好,大于 l000 mg/L 時無明顯降解效果。岳黎等[27]從石油污染土壤中分離得到1株苯酚降解菌經(jīng)鑒定為黏質(zhì)沙雷氏菌,24 h 內(nèi) 10 mmol/L 的苯酚降解率達(dá)到 99.29%。董小培等[28]從蘭州石化污水處理廠分離到兩株苯酚降解菌 lsd03,lsd05 在 1000 mg/L 的苯酚無機(jī)鹽培養(yǎng)基中達(dá)到對數(shù)生長期分別需要 80 h 和 60h。褚蓓等[29]從鋼鐵焦化廠污水中分離到 4 株菌, 72 h 可將 1500 mg/L 的苯酚完全降解,最高可耐受 3000 mg/L 的苯酚。與前人分離的菌株相比 ad049 的降解能力相對較強(qiáng),由于與含酚廢水相比,石油污染的土壤中苯酚含量較低,所以分離的菌株活性相對比較弱。因此,菌株 ad049 可以為微生物修復(fù)苯酚污染提供高效菌源。

2.4 菌株 ad049 的酶活性

2.4.1 菌株 ad049 的脫氫酶活性

脫氫酶能使有機(jī)底物的氫原子活化并傳遞給特定的受氫體,在微生物降解有機(jī)物機(jī)制中起主要作用。脫氫酶的活性可以用來反映處理體系中活性微生物的量及其對有機(jī)物的降解能力。因此,可以通過測定菌液的脫氫酶活性來評價該菌對有機(jī)物的降解能力[30]。

本研究通過TTC 法測定了菌株 ad049 的脫氫酶活性為(71.07±9.01) mg·L-1·h-1。宋廣梅[21]也研究測定了幾株高效石油降解菌株的脫氫酶活性,其脫氫酶活性大小為 5—119 mg·L-1·h-1,菌株 ad049與其相比脫氫酶活性相對較高。因此,可以說明菌株 ad049 對于有機(jī)底物苯酚的降解能力相對比較高。

2.4.2 菌株 ad049 的鄰苯二酚雙加氧酶活性

鄰苯二酚雙加氧酶(Catechol Dioxygenase)是芳香族化合物代謝途徑中的關(guān)鍵酶,存在于一些芳香族化合物的降解菌中。在已研究的苯酚降解菌中,苯酚的降解產(chǎn)物鄰苯二酚或者通過鄰苯二酚1,2-雙加氧酶(C12O)進(jìn)行鄰位開環(huán),或者通過鄰苯二酚2,3-雙加氧酶(C23O)在兩個羥基之旁間位開環(huán),然后通過不同的下游途徑進(jìn)入三羧酸循環(huán)[23]。為了研究 ad049 菌株中苯酚的降解途徑,測定了C12O 和 C23O 的酶活性,測定結(jié)果如表 2 所示。

表2 菌株 ad049 的 C12O 和 C23O 酶活性

結(jié)果表明,在以苯酚為底物的情況下,菌株 ad049 的鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的胞內(nèi)和胞外酶活分別為(105.93±12.87) U 和(19.87±4.32) U,鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的胞內(nèi)和胞外酶活分別為(36.14±1.93) U 和(10.11±3.01) U。同一培養(yǎng)條件下該菌的細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)上清液中酶活性有顯著的差異,說明這株菌中的鄰苯二酚酶是胞內(nèi)酶,其酶蛋白絕大部分存在于細(xì)胞內(nèi),分泌到胞外的數(shù)量比較有限。根據(jù)以上結(jié)果可以推測出在該實(shí)驗(yàn)條件下,菌株 ad049 可能是先將苯酚降解為鄰苯二酚,接著以鄰苯二酚 1,2 雙加氧酶為主要途徑進(jìn)行鄰位開環(huán),輔助以鄰苯二酚 2,3雙加氧酶進(jìn)行間位開環(huán),徹底降解苯酚。推測得出的菌株 ad049苯酚降解途徑與張瑾華[31]等研究的紅球菌 DF51 降解苯酚的途徑相似,都是以鄰苯二酚 1,2 雙加氧酶為主要途徑,輔以鄰苯二酚 1,2 雙加氧酶進(jìn)行降解。

2.5 菌株 ad049 動力學(xué)分析

為了研究菌株 ad049 降解苯酚的動力學(xué),分別對菌株在 500、1000、1500 mg/L 苯酚濃度下的降解過程進(jìn)行了分析。菌株ad049對苯酚的代謝動力學(xué)可以用零級動力學(xué)方程C=-k0t+A來描述,式中C為在時間t時的苯酚濃度(mg/L),k0是速率常數(shù)(mg L-1h-1),A是常數(shù)。

表3 菌株 ad049 的動力學(xué)模型

如表 3 所示,在 500、1000、1500 mg/L 苯酚濃度下,零級動力學(xué)方程的速率常數(shù)分別為 42.19、41.51和32.32 mg·L-1·h-1,相關(guān)系數(shù)R2分別為 0.99、0.96和0.95,相關(guān)系數(shù)比較大且接近于 1,說明菌株 ad049 降解苯酚的過程能夠很好地符合零級動力學(xué)模型。另外可以得出,隨著苯酚濃度的增大,速率常數(shù)減小,降解速度減小,因此降解所需要的時間增大。Qiao Lin[32]等在副球菌降解嘧啶的研究中也得出相似的結(jié)論,固定化菌和游離菌對于嘧啶的降解都很好的符合零級動力學(xué)方程。

3 結(jié)論

(1)從陜北靖邊油田污染土壤中篩選出了一株高效苯酚降解菌株命名為 ad049,通過形態(tài)觀察、生理生化檢驗(yàn)和 16S rDNA 序列比對,確定該菌株為紅球菌屬(Rhodococcus)。

(2)對菌株 ad049 降解特性進(jìn)行了研究,得到該菌株具有較強(qiáng)的苯酚降解能力,在初始苯酚質(zhì)量濃度為 1000 mg/L,溫度為 35 ℃,pH 值為 8,接種量為 5% 的條件下培養(yǎng) 24 h 后,可使 1 000 mg/L 的苯酚降解率達(dá)到 99% 以上。

(3)測定了菌株 ad049 的脫氫酶活性和鄰苯二酚雙加氧酶活性,與已研究的苯酚降解菌相比,該菌株的酶活性相對較高,說明該菌降解苯酚的效果比較好。并且推測菌株 ad049 降解苯酚的途徑是以鄰苯二酚 1,2 雙加氧酶為主要途徑進(jìn)行鄰位開環(huán),輔以鄰苯二酚 2,3雙加氧酶進(jìn)行間位開環(huán)。

(4)對菌株 ad049 在不同苯酚濃度下的降解過程進(jìn)行動力學(xué)分析,得到整個降解過程符合零級動力學(xué)方程。

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Identification and characteristics of phenol degrading bacteria ad049 screened from oil contaminated soil

HU Ting1, GU Jie1,2，*, ZHEN Lisha1,3,YANG Jiu1,SHI Longxiang1,WANG Xiaojuan1, GAO Hua1,2

1CollegeofNaturalResourcesandEnvironment,NorthwestAgricultureandForestryUniversity,Yangling712100,China2TheResearchCenterofRecycleAgriculturalEngineeringandTechnologyofShaanxiProvince,Yangling712100,China3ShaanxiProvinceMicrobiologyInstitute,Xi′an710043,China

A bacterium strain, which prove to be highly effective in phenol degrading, was isolated from soil contaminated with oil in Jingbian oilfield of Northern Shaanxi by using enrichment culture method with phenol as a sole carbon source. The bacterium was named ad049 and identified asRhodococcuson the basis of the morphological characterizations, physiological and biochemical identification, and alignment analysis of the 16S rDNA sequence. Effects of inoculation quantity of ad049, pH, temperature, and concentration of phenol as a substrate on bacterial growth and the efficiency of ad049 on phenol degradation were also investigated by shaker culture method, and dehydrogenase and catechol dioxygenase were determined as well. Results showed that the ad049 had a strong biodegradation capability for phenol. It degraded 99% of the phenol in a concentration of 1000 mg/L in 24 hours under the incubating condition of 30 ℃, pH 8, and 5% of ad049 inoculation. The degradation process could be described with zero order kinetics equation with the k0andR2values of 41.51and 0.96, respectively. The degradation of phenol by ad049 might be achieved largely by 1,2-dioxygenase for ortho ring opening of benzene, and partly by catechol 2,3-dioxygenase for meta-cleavage.

oil contaminated soil; phenol; biodegradation;Rhodococcus

國家自然科學(xué)基金(4087119,41171203); 農(nóng)業(yè)部“948”項(xiàng)目(2010-Z20);陜西省科學(xué)院青年人才項(xiàng)目(2012K- 34)

2013- 06- 09;

2013- 09- 22

10.5846/stxb201306091528

*通訊作者Corresponding author.E-mail: gujoyer@sina.com

胡婷,谷潔,甄麗莎,楊玖,史龍翔,王小娟,高華.石油污染土壤中苯酚降解菌ad049的鑒定及降解特性.生態(tài)學(xué)報(bào),2014,34(5):1140- 1148.

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