王 超, 申成美, 鄭 麗, 薛慶云, 郭堅(jiān)華

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)系，江蘇省生物源農(nóng)藥工程中心，農(nóng)作物生物災(zāi)害綜合 治理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210095)

煙草青枯病生防細(xì)菌的篩選與生防效果研究

王 超, 申成美, 鄭 麗, 薛慶云, 郭堅(jiān)華*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)系，江蘇省生物源農(nóng)藥工程中心，農(nóng)作物生物災(zāi)害綜合 治理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210095)

從云南文山煙草種植田煙草植株根圍土壤及植株根內(nèi)生境中分離純化獲得195株細(xì)菌，以細(xì)菌菌株對青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)YN10的拮抗作用及其產(chǎn)蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和產(chǎn)嗜鐵素的活性作為評價指標(biāo)對其生防潛力進(jìn)行賦值，對總賦值得分較高的84株菌株做了聚類分析，選擇25株拮抗細(xì)菌進(jìn)行了煙草青枯病溫室防效試驗(yàn)。結(jié)果表明，聚類分析ARDRA圖譜中位于不同組的25株拮抗細(xì)菌對煙草青枯病都有不同程度的防治效果，菌株K-1-8、R-3-16、R-3-18的溫室防效分別為86.66%、84.94%、87.57%；拮抗細(xì)菌的生防效果與總賦值存在正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.86。

生防細(xì)菌； 煙草青枯病； 酶活性； 賦值評估； 聚類分析

煙草(NicotianatabacumL.)是雙子葉植物綱(Dicotyledoneae) 茄科(Solanaceae) 一年生草本植物，具有極高的經(jīng)濟(jì)價值，是煙草栽培地區(qū)農(nóng)民收入、地方財(cái)政和國家稅收的重要來源之一[1]。煙草青枯病是由茄青枯雷爾氏菌(RalstoniasolanacearumE.F.Smith)引起的維管束病害，是一種毀滅性的土傳細(xì)菌性病害[2]，嚴(yán)重影響煙草的產(chǎn)量與品質(zhì)。

隨著煙草種植期延長、病菌致病力發(fā)生變化，我國主栽品種‘K326’的抗性逐漸退化，加之栽培管理很難控制，目前煙草青枯病的防治主要依靠化學(xué)藥劑來控制和減輕危害[3]。化學(xué)藥劑對青枯病雖能起到一定的控制作用，但由于抗藥性和農(nóng)藥殘留等問題，青枯病的生物防治因其對環(huán)境、生態(tài)和人畜的安全性引起國內(nèi)外學(xué)者越來越多的重視[4]。Wang等研究發(fā)現(xiàn)拮抗菌株K1、K2 對煙草青枯病有明顯的抑制作用,且適當(dāng)濃度的K1、K2 能改變和破壞青枯菌的形態(tài)[5]；曾維愛等的研究表明,苗期接種菌根真菌結(jié)合生防制劑不僅能夠有效地防治煙草青枯病,還能改善煙株的農(nóng)藝性狀,改善煙葉品質(zhì)[6]；劉偉等在煙草根際土壤篩選出一株對煙草青枯菌有較明顯抑制作用的甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌LW-6[7]。李紅麗等認(rèn)為在病害的原位土壤中分離篩選對病原菌具有拮抗效果的微生物并制成微生物有機(jī)肥來防治土傳病害，防病的同時可以改善和修復(fù)土壤生態(tài)環(huán)境[8]。

本研究在云南文山煙草種植田煙草植株根圍土壤及植株根內(nèi)生境中分離純化獲得了195株細(xì)菌，并以拮抗作用、胞外酶活性以及分泌嗜鐵素為指標(biāo)，結(jié)合ARDRA聚類分析選取了25株細(xì)菌進(jìn)行了溫室防治試驗(yàn)，為土傳病害生防細(xì)菌的篩選及煙草青枯病的生物防治提供了方法參考和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試植物及試驗(yàn)材料

供試煙草品種為三生煙(Nicotianatobacum‘Samsun’)。青枯雷爾氏菌(R.solanacearum)YN10由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基、YGPA培養(yǎng)基[9]和R2A培養(yǎng)基[10]。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司，引物由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑、限制酶等均購自 TaKaRa 公司。

1.2 樣品采集和細(xì)菌分離

分離樣品取自收獲季節(jié)的云南省文山市西疇鎮(zhèn)石門坎煙草地，田間采用五點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)取健康植株3株和病株2株，采集部位為煙草植株的根系及根圍土(輕拍根系去除根表浮土，用刷子刷下緊附于根表的土即為根圍土)，病健株分開取樣。

取3g根圍土壤樣品，于無菌三角瓶中加27 mL無菌的0.85% NaCl溶液和3g滅菌玻璃珠120r/min 振蕩培養(yǎng)30min，靜置5 min后梯度稀釋，分別取10-4、10-5、10-6稀釋液100μL 涂布在R2A培養(yǎng)基上，每個梯度3個重復(fù)，30℃培養(yǎng)48 h。

分別取煙草根系樣品若干，用1%次氯酸鈉浸泡5 min，70%乙醇浸泡1～2 min，無菌水清洗3次后，取3g樣品加27 mL無菌0.85% NaCl溶液研磨，梯度稀釋后取100μL 10-1、10-2、10-3稀釋液涂于R2A培養(yǎng)基上，每個梯度3個重復(fù)，30℃培養(yǎng)48 h。

選菌落數(shù)在30～300個的平板，計(jì)數(shù)，挑取不同大小、形態(tài)的菌落分離、純化，40%甘油保存于-70℃超低溫冰箱中，備用。

1.3 細(xì)菌對YN10平板抑制活性檢測

采用平板對峙法檢測分離所得細(xì)菌的拮抗活性，病原指示菌為YN10，培養(yǎng)平板使用YGPA培養(yǎng)基，具體操作參考謝永麗等[11]的方法，進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，每株參試細(xì)菌設(shè)置3個重復(fù)。

1.4 細(xì)菌水解酶活性的測定

1.4.1 蛋白酶活性測定

在蛋白酶平板上(A：脫脂奶粉8 g，溶于300mL水中，115 ℃滅菌10min；B：瓊脂8 g，定容至300mL，121℃滅菌20min，A與B分別滅菌后混合)接菌，30℃培養(yǎng)3d后觀察透明圈有無，并記錄大小[10]。

1.4.2 幾丁質(zhì)酶活性測定

將細(xì)菌在以膠體狀幾丁質(zhì)[12]為唯一碳源的培養(yǎng)基(Chi-Ayers)上培養(yǎng)(磷酸二氫銨1.0g，氯化鉀0.2 g，水合硫酸鎂0.2 g，膠體狀幾丁質(zhì)1%(W/V)100mL，瓊脂20g，pH=7.0)，接菌后30℃培養(yǎng)3d，觀察透明圈有無，并記錄大小[13]。

1.4.3 纖維素酶活性測定

參照Ghose 的方法[14]，把準(zhǔn)備好的菌株接到纖維素酶活性測定平板上(蛋白胨10g，酵母粉10g，羧甲基纖維素鈉10g，氯化鈉5 g，磷酸二氫鉀1g，瓊脂18 g，pH=7.0)，30℃培養(yǎng)3d后，用1g/L的剛果紅染1h后，倒掉染液，再用1mol/L NaCl溶液浸泡1h，觀察透明圈有無，并記錄大小。

1.5 產(chǎn)嗜鐵素活性測定

參照Shin等的方法[15]。A：① 60.5 mg鉻天青S溶于50mL去離子水；② 10mL三價鐵溶液(1mmol/L FeCl3·6H2O，10mmol/L鹽酸為溶劑)；③ 72.9 mg CTAB 溶于40mL去離子水。上述3個溶液混合定容至100mL，pH調(diào)至中性，121℃滅菌20min。B：30.24 g Pipes加入 900mL WA培養(yǎng)基，pH=6.8，121℃滅菌20min。A、B液混合倒平板，接菌后30℃培養(yǎng)3d，觀察、記錄結(jié)果。

1.6 細(xì)菌的賦值評估

根據(jù)Faltin等的方法[16]，對拮抗細(xì)菌的生防潛力進(jìn)行賦值評估，評分如下：平板拮抗YN10活性、產(chǎn)蛋白酶、幾丁質(zhì)酶活性和產(chǎn)嗜鐵素各3分，其中抑菌圈或透明圈半徑0～3mm為1分，3～6mm賦2分，> 6mm的賦3分；產(chǎn)纖維素酶1分，總分為13分。

1.7 細(xì)菌聚類分析

利用基因組DNA試劑盒提取細(xì)菌的基因組DNA。采用引物U8-27(F)5′-AGAGTTTGA TC(AC)TGGCTCAG-3′和L1494-1514(R) 5′-CTACGG(AG)TACCTTGTTACGAC-3′擴(kuò)增細(xì)菌基因組DNA中的16S rDNA片段[10]。反應(yīng)體系為25 μL體系，包括10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+3.75 μL，dNTP 2 μL，引物P1/P2 0.6μL，模板DNA 1μL，rTaq酶0.5 μL和H2O。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min，94 ℃ 1min，56℃ 1min，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)，72 ℃ 10min，12 ℃恒定保溫。

取10μL 16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物用MspI酶切(37 ℃，3h)后于混合凝膠檢測(1.5%瓊脂糖+1.5% Synergel，1.0× TAE，80V，1.5 h)，用GelCompar?Ⅱversion 4.5進(jìn)行圖譜的聚類分析。

1.8 溫室防效試驗(yàn)

1.8.1 供試菌株菌懸液及病原菌菌懸液的制備

取保存于-70℃超低溫冰箱中的供試細(xì)菌菌株及病原菌YN10畫線培養(yǎng)于LB及YGPA平板培養(yǎng)基上。在28 ℃下培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接于相應(yīng)培養(yǎng)液中，28 ℃，200r/min，培養(yǎng)24 h成種子液。以1∶100的比率在相應(yīng)培養(yǎng)液中擴(kuò)繁。28 ℃，200r/min，擴(kuò)繁24 h后所得菌液相應(yīng)培養(yǎng)液稀釋，其中供試細(xì)菌濃度調(diào)至 5×108cfu/mL，YN10濃度調(diào)至 5×107cfu/mL，備用。

1.8.2 供試菌株對煙草青枯病的溫室防治試驗(yàn)

煙草種子經(jīng)塑料穴盤育苗后，將生長一致的三葉期煙草幼苗移栽至容積約為355 cm3的一次性塑料杯子中繼續(xù)培養(yǎng)(溫度26～28 ℃，L∥D=14 h∥10h)。待煙草植株生長至6～7葉期時進(jìn)行處理，生防菌處理組每株苗澆灌20mL供試菌株菌液，對照組澆灌等體積清水。每個處理組24株煙草苗，每個處理3個重復(fù)。供試菌株處理7 d后澆灌YN10菌液，每株20mL。病原菌處理后每天觀察其生長狀況和發(fā)病情況，26d后統(tǒng)計(jì)最終結(jié)果。按照Kempe等[17]提出的病級標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)病情。病害嚴(yán)重度和防效的計(jì)算公式如下：

病害嚴(yán)重度(%)=

生防效果(%)=

1.9 數(shù)據(jù)分析

在Microsoft Excel中對平板酶活圈、生防效果等數(shù)據(jù)進(jìn)行簡單處理和相關(guān)性分析，顯著水平(P<0.05)由DPS v 7.05獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草不同生境細(xì)菌分離結(jié)果

從煙草不同生境中共分離到195株細(xì)菌，其中健株根圍樣品分離到80株，病株根圍分離到20株，健株根內(nèi)分離得到53株，病株根內(nèi)分離得到42株。在不同生境中，細(xì)菌種群密度差異明顯，煙草根圍細(xì)菌密度明顯高于根內(nèi)細(xì)菌密度，根圍生境及根內(nèi)生境的細(xì)菌密度分別約為5.20×105cfu/g rs(rhizosphere soil，根圍土)，8.90×103cfu/g fw(fresh weight,根鮮重)。

2.2 煙草不同生境細(xì)菌對青枯病生防能力評估

對從不同生境分離到的195株細(xì)菌進(jìn)行了離體拮抗試驗(yàn)，共有28株細(xì)菌具有拮抗作用。各種酶活性的測定結(jié)果表明，產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌所占的比例最高，為75%；而產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的細(xì)菌所占的比例最低，為6%；產(chǎn)纖維素酶、嗜鐵素的細(xì)菌所占的比例分別為19%和66%。

對上述細(xì)菌菌株生物防治煙草青枯病的潛力進(jìn)行了賦值評估，菌株的總得分在1～8分之間。

2.3 聚類分析結(jié)果

為了揭示所獲得的煙草生境細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)，利用ARDRA圖譜分析方法對總賦值得分3分以上的84個生防潛力菌株進(jìn)行了聚類分析(圖 1)，在70%的相似系數(shù)下，84個潛力菌株可劃分為12個組(G1～G12)。在這12個組中，只有G1中包含了較多的菌株為36株，G6和G8各含有1株菌株，G9有10株菌株，其他組中包含的菌株數(shù)目差別不大，分別為4、6、4、3、5、7、2和5株菌株。

2.4 供試菌株對煙草青枯病的溫室防效

根據(jù)賦值評估及聚類分析結(jié)果，選擇了8個組(G1、G2、G3、G4、G7、G9、G10和G11)中的25株細(xì)菌作為生防潛力菌株進(jìn)行煙草青枯病溫室防效試驗(yàn)(表1)。接種YN10后第7天對照組煙草植株即開始發(fā)病，底部葉片開始萎蔫，而供試菌株處理組均不同程度推遲了植株的感病時間，病原菌接種后第26天進(jìn)行了病害嚴(yán)重度的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明25株供試細(xì)菌對煙草青枯病均具有一定的防治效果(表1)，供試菌株的溫室防效達(dá)87.57%(圖1)。

表125株供試細(xì)菌生防潛力的評估及對煙草青枯病的溫室防治效果1)

Table1Assessmentsof25testedstrainsfortheirbiocontrolabilitiesandtheirbiocontrolefficiencyontobaccobacterialwiltingreenhouse

供試菌株Testedstrains生防潛力評估Assessmentforbiocontrolability拮抗活性Antagonism蛋白酶Proteases幾丁質(zhì)酶Chitinases纖維素酶Cellulases嗜鐵素Siderophores賦值A(chǔ)ssessmentpoints溫室試驗(yàn)Greenhouseexperiments病害嚴(yán)重度/%Diseaseseverity生防效果/%BiocontrolefficiencyR?3?1833--28(7．73±0．44)h87．57K?1?823-128(8．30±0．06)g86．66R?3?1623--27(9．36±0．32)g84．94R?5?17-3--36(15．29±0．07)f75．41J?3?833--17(16．59±0．33)f73．33R?2?1723-117(18．42±0．09)ef70．37J?4?233--17(19．26±0．15)e69．03K?1?723--16(19．45±0．01)e68．72R?4?1633---6(19．54±0．10)e68．58R?1?73-1-26(20．58±0．25)e66．91J?3?323--16(23．42±0．04)e62．34R?4?202-2-15(26．17±0．26)d57．92K?1?9-221-5(26．41±0．03)d57．54R?2?8211-15(26．42±0．08)d57．52K?1?5-3--25(27．78±0．01)cd55．33R?3?1413---4(27．78±0．09)cd55．33R?1?1723---5(29．34±0．10)cd52．82R?4?11311-6(29．45±0．39)cd52．64R?4?1223-1-6(30．27±0．05)c51．32R?5?2023--16(31．59±2．40)c49．21R?3?1123-1-6(33．38±0．43)c46．33R?2?1113---4(36．50±0．18)bc41．31K?1?612-1-4(37．55±0．22)bc39．61J?3?21---23(41．23±1．42)b33．69R?5?183---14(41．37±1．46)b33．47對照Control------(62．19±1．01)a-

1) 數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母表示處理間在P<0.05的顯著水平差異顯著(LSD test)。 The values are mean ± SD.Different small letters within a column indicate significant difference by the LSD test (P<0.05).

圖1 供試細(xì)菌R-3-18對煙草青枯病的溫室防效Fig.1 Effects of the tested strain R-3-18 against tobacco bacterial wilt in greenhouse

2.5 相關(guān)性分析

對25株供試細(xì)菌的溫室防效和生防潛力總賦值進(jìn)行了相關(guān)系數(shù)分析，以確定我們所采用的賦值系統(tǒng)的可行性。結(jié)果顯示(圖 2)，溫室防效與總賦值之間存在正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.86。

圖2 生防潛力菌株總賦值與溫室防效的相關(guān)性Fig.2 Correlation analysis between assessment points of potential biocontrol agents and their biocontrol efficiency in greenhouse

3 討論

在植物根際和土壤中存在著大量的細(xì)菌，其中包括很多對病原菌具有抑制作用的拮抗細(xì)菌，可以利用特定的方法分離培養(yǎng)獲得[18]。針對青枯病的土傳性、維管束發(fā)病特點(diǎn)，我們從煙草根圍和根內(nèi)生境分離細(xì)菌，通過平板拮抗活性、產(chǎn)酶活性及嗜鐵素分泌等一系列離體試驗(yàn)對所得菌株進(jìn)行賦值，結(jié)合ARDRA聚類分析建立了一個快速、高效的生防菌篩選體系，從云南文山煙草種植田煙草生境分離純化獲得195株細(xì)菌中篩選出11株溫室防治青枯病效果在60%以上的生防細(xì)菌。因此，對于植物土傳病害來說，根際土壤和根組織是生防細(xì)菌的良好來源。

一個恰當(dāng)?shù)捏w外評價系統(tǒng)對生防菌的高效篩選來說意義重大，Berg等針對馬鈴薯真菌病害的生物防治建立了篩選內(nèi)生細(xì)菌的評價系統(tǒng)[19]，對于煙草青枯病生防細(xì)菌的篩選，本研究以拮抗活性以及蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和嗜鐵素等抗細(xì)菌物質(zhì)作為體外評估指標(biāo)，篩選出的供試細(xì)菌生防潛力總賦值與溫室防效的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.86，驗(yàn)證了該篩選體系的可靠性，同時表明拮抗作用和抗菌物質(zhì)是25株生防細(xì)菌防治煙草青枯病的主要作用機(jī)制。生防細(xì)菌的作用機(jī)理包括產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、種群競爭和誘導(dǎo)抗病性等許多方面[20]。因此，要構(gòu)建一個全面準(zhǔn)確的生防細(xì)菌高效篩選體系，我們還需要綜合更多的作用機(jī)制來全面評估供試菌株的生防潛力。

本研究中發(fā)現(xiàn)了3株細(xì)菌R-3-18、K-3-16和R-5-17在溫室試驗(yàn)中表現(xiàn)了良好的生防潛力，經(jīng)16S rDNA序列比對鑒定為微桿菌屬(Microbacteriumspp.)和微小桿菌屬(Exiguobacteriumspp.)細(xì)菌，作為首次發(fā)現(xiàn)這兩個屬細(xì)菌在煙草青枯病生物防治方面的效果，我們已對其生防機(jī)理進(jìn)行了深入探究(另文發(fā)表)。

受煙草生長環(huán)境影響，青枯病的田間生物防治相對困難，常規(guī)生物防治中單一菌劑在復(fù)雜的環(huán)境中適應(yīng)性較差，從而導(dǎo)致防治效果偏低[21-23]。本研究篩選得到了11株溫室防效較好的菌株，其田間防效需進(jìn)一步驗(yàn)證，兩株細(xì)菌及多株細(xì)菌復(fù)配使用也值得深入探究。

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Isolationandscreeningofantagonisticbacterialstrainsandtheirbiocontrolefficiencyagainstbacterialwilt

Wang Chao, Shen Chengmei, Zheng Li, Xue Qingyun, Guo Jianhua

(DepartmentofPlantPathology,CollegeofPlantProtection,NanjingAgriculturalUniversity;EngineeringCenterofBioresourcePesticideinJiangsuProvince;KeyLaboratoryofIntegratedManagementofCropDiseasesandPests,MinistryofEducation,Nanjing210095,China)

In order to screen antagonistic bacteria for controlling tobacco bacterial wilt,195 bacterial strains were isolated and purified from rhizosphere soil and endorhiza of tobacco plants in Wenshan,Yunnan Province.Assessment was made according to their antagonistic activity againstRalstoniasolanacearumYN10and the ability to secrete hydrolytic enzymes and siderophoresinvitro.Eighty-four strains with higher assessment points were selected for cluster analysis.Finally,the antagonistic activity of 25 potential biocontrol agents(BCA)againstR.solanacearumwere investigated to in greenhouse.Three BCA isolated,K-1-8,R-3-16and R-3-18 were demonstrated to have good control efficiency on tobacco bacterial wilt,with the efficiency of 86.66%,84.94% and 87.57%,respectively.The results of the assessment system were positively correlated (r=0.86) with those obtained from the greenhouse experiment.

biocontrol agents; tobacco bacterial wilt; enzyme activity; assessment; cluster analysis

2013-06-26

：2013-08-31

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31177809)

S 476

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.008

* 通信作者 E-mail: jhguo@njau.edu.cn