劉 芳， 馬琨玲， 蘭平秀， 繆玉東， 李曉靜， 李 凡*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；3. 云南大理州煙草公司大理市分公司，大理 671000；4. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201)

實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)

從煙草叢頂病病原復(fù)合物中分離煙草扭脈病毒的方法

劉 芳1，2#， 馬琨玲3#， 蘭平秀4， 繆玉東2， 李曉靜1， 李 凡1*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；3. 云南大理州煙草公司大理市分公司，大理 671000；4. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201)

煙草叢頂病是由煙草叢頂病毒(TBTV)、煙草叢頂病毒類(lèi)似衛(wèi)星RNA(Sat-TBTV)、煙草扭脈病毒(TVDV)和煙草扭脈病毒相關(guān)RNA(TVDVaRNA)復(fù)合侵染引起的一類(lèi)特殊病害，目前尚不清楚這些病原物各自在病害癥狀形成和病害傳播中的作用。本文根據(jù)蚜蟲(chóng)傳播煙草叢頂病復(fù)合病原物傳毒特性的差異，探索了3種分離TVDV的生物學(xué)方法。方法A為將獲得了煙草叢頂病復(fù)合病原物的蚜蟲(chóng)饑餓24 h后，以單蟲(chóng)單苗的方式接到健康煙株上傳毒，24 h后滅蟲(chóng)。方法B為將無(wú)毒蚜蟲(chóng)饑餓2～4 h后轉(zhuǎn)接到感病煙株上飼毒48 h，再以單蟲(chóng)單苗的方式接到健康煙株上傳毒，24 h后滅蟲(chóng)。方法C為將無(wú)毒蚜蟲(chóng)于感病煙株上飼毒48 h后，以單蟲(chóng)單苗的方式接到健康煙株上傳毒24 h，此后每隔24 h將蚜蟲(chóng)移到另一健康煙株上傳毒，直到蚜蟲(chóng)死亡。其中方法A和B均可將TVDV從煙草叢頂病病原復(fù)合體中分開(kāi)，方法A操作簡(jiǎn)單、分離周期短且TVDV的分離效率高。單獨(dú)TVDV侵染的煙株無(wú)明顯的叢頂癥狀，葉片靠近主脈的地方會(huì)出現(xiàn)皺縮，生長(zhǎng)后期葉片變得細(xì)長(zhǎng)且頂端會(huì)發(fā)生扭曲。本試驗(yàn)可為研究TVDV與其他病原物、寄主植物和傳播介體的相互作用提供很好的試驗(yàn)材料，也可為蚜蟲(chóng)傳播的復(fù)合侵染病毒的生物學(xué)分離提供參考。

煙草叢頂病； 病原復(fù)合物； 煙草扭脈病毒； 蚜蟲(chóng)； 生物學(xué)分離

煙草扭脈病毒(Tobaccoveindistortingvirus，TVDV)為黃癥病毒科(Luteoviridae)馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)成員[1-2]，TVDV與煙草叢頂病毒(Tobaccobushytopvirus，TBTV)、煙草叢頂病毒類(lèi)似衛(wèi)星RNA(Tobaccobushytopvirussatellite-like RNA，Sat-TBTV)及煙草扭脈病毒相關(guān)RNA(Tobaccoveindistortingvirus-associated RNA，TVDVaRNA)等病原物復(fù)合侵染引起煙草叢頂病(tobacco bushy top disease，TBTD)。1957年煙草叢頂病首先在津巴布韋北部的春克旺里煙區(qū)暴發(fā)[1]，接著便在津巴布韋鄰國(guó)馬拉維、南非等國(guó)家發(fā)生[3]。在我國(guó)云南省的保山、大理、楚雄等煙區(qū)曾大面積暴發(fā)流行，給煙區(qū)生產(chǎn)帶來(lái)了重大損失[4-5]，目前該病在我國(guó)僅云南有報(bào)道發(fā)生。

TVDV是引起煙草叢頂病的主要病毒之一，2010年Mo等獲得了TVDV的全基因組序列[6]，該病毒基因組全長(zhǎng)為5 920 bp，具有6個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框(open reading frames，ORFs)。通過(guò)比對(duì)其RdRp和CP序列，顯示TVDV與黃癥病毒科的馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)具有很高的同源性，ICTV 第9次分類(lèi)報(bào)告將TVDV歸為該屬的確定成員[7]。

在自然條件下表現(xiàn)典型煙草叢頂病癥狀的煙株中，TVDV總是與TBTV等病原物復(fù)合侵染，人工獲得單獨(dú)感染TVDV的煙株極為困難，只有Smith和Cole報(bào)道在偶然的機(jī)會(huì)下曾分離到單獨(dú)感染TVDV的煙株[2，8]。TVDV局限在寄主的韌皮部，病毒含量低，不易直接從病株里提純到病毒粒子，并且TVDV編碼的CP(coat protein)可能異源包裹了TBTV、Sat-TBTV及TVDVaRNA等病原的RNA，因此很難通過(guò)提純病毒的方法獲得單獨(dú)的TVDV。

TBTV為幽影病毒屬(Umbravirus)成員，可以通過(guò)機(jī)械接種方式傳播，在輔助病毒TVDV的幫助下還可以通過(guò)蚜蟲(chóng)以持久性方式傳播，單獨(dú)的TBTV不能通過(guò)蚜蟲(chóng)傳播[5]。而TVDV只能通過(guò)蚜蟲(chóng)傳播，不能經(jīng)機(jī)械摩擦傳播[5]。另外，迄今尚未發(fā)現(xiàn)TBTD各病原物的枯斑寄主，無(wú)法通過(guò)枯斑寄主分離法獲得單獨(dú)的TVDV。要想獲得單一的TVDV，目前只能通過(guò)構(gòu)建其侵染性cDNA克隆，但是由于植物RNA病毒產(chǎn)生侵染性轉(zhuǎn)錄物所涉及的體外逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶的忠實(shí)性并非百分之百，必然會(huì)產(chǎn)生突變，這可能導(dǎo)致所獲得的cDNA克隆沒(méi)有侵染性[9]。到目前為止，只有為數(shù)不多的植物病毒獲得了侵染性的cDNA克隆。鑒于TVDV只能通過(guò)蚜蟲(chóng)傳播，因此本文嘗試通過(guò)生物學(xué)方法來(lái)分離TVDV，設(shè)計(jì)了多種蚜蟲(chóng)傳毒方法，通過(guò)大量的單蟲(chóng)單苗傳毒方法，獲得了只含有 TVDV 的煙株。另外，研究表明TBTV在病害的癥狀表現(xiàn)中起主要作用，而TBTV的遠(yuǎn)距離傳播主要依靠TVDV編碼的外殼蛋白將其包裹后由蚜蟲(chóng)傳播，所以TVDV在煙草叢頂病的發(fā)生和流行危害中起到了重要作用。因此分離獲得單獨(dú)感染TVDV的試驗(yàn)材料對(duì)研究煙草叢頂病的發(fā)生、傳播及防治就顯得非常重要，并將極大促進(jìn)對(duì)TVDV與煙草叢頂病的其他病原物、寄主植物及傳播介體之間的相互作用的研究。本文根據(jù)煙草叢頂病復(fù)合病原物經(jīng)蚜蟲(chóng)傳毒的差異，通過(guò)生物學(xué)的方法探索出2種能分離獲得單一TVDV的方法，希望可以為多種病毒復(fù)合侵染病害的病毒分離提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 毒源及健康煙株

煙草叢頂病感病煙株采自保山市隆陽(yáng)區(qū)潞江鎮(zhèn)東松村委會(huì)，發(fā)病煙株表現(xiàn)為頂端優(yōu)勢(shì)喪失、葉片褪綠黃化、側(cè)枝叢生和節(jié)間縮短等癥狀。病株于無(wú)蟲(chóng)溫室栽培并用蚜蟲(chóng)傳毒方式保存?zhèn)溆?，健康煙株均為防蟲(chóng)溫室培育的烤煙品種‘K326’。

1.2 分子生物學(xué)常用酶和試劑盒

RNA提取試劑為T(mén)RIpure Reagent，為北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品， Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)、TaKaRa TaqTM均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。通用型DNA純化回收試劑盒(離心柱型)購(gòu)自天根生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.3 檢測(cè)引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI中登錄的TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA基因序列(登錄號(hào)分別為：AF402620、EF529624、AJ315135和EF529625)分別設(shè)計(jì)了檢測(cè)TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的特異引物，由深圳華大基因公司合成，見(jiàn)表1。

表1檢測(cè)TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的引物

Table1ListofprimersusedfordetectionofTBTV,TVDV,Sat-TBTVandTVDVaRNA

引物名稱(chēng)1)Primer序列(5′?3′)Sequence擴(kuò)增片段大小/bpFragmentlength所檢測(cè)病原物TargetvirusTBTVdFTACCACACCTAAACAGCGTTGTBTVdRCTCATCTCCCGCTAAGTCAG1049TBTVTVDVdFAGCCAAGCATACATCAGTTGCATVDVdRGTCTACCTATTTGGGGTTGTG803TVDVSatTBTVdFTGTTGGCCGTGGGCAGCAASatTBTVdRTTCGTATTTGGCTCCGTCGC598Sat?TBTVTVDVaRNAdFGCGTACTGCGGAAGTCTCACTVDVaRNAdRTGTACTGGAGTGCTTCAACCG792TVDVaRNA

1) F：正義鏈引物； R：反義鏈引物。
F：Sense primer; R：Antisense primer.

1.4 無(wú)毒蚜蟲(chóng)的獲得

將田間采集的煙蚜挑到白菜上，在網(wǎng)箱隔離條件下繁殖，將每一代的仔蚜移到另一白菜上進(jìn)行脫毒，脫毒至第10代，經(jīng)檢測(cè)無(wú)毒后在白菜上擴(kuò)大培養(yǎng)備用。

1.5 TVDV的生物學(xué)分離方法

方法A：先將無(wú)毒蚜蟲(chóng)在煙草叢頂病染病煙株上飼毒繁殖數(shù)代后，用毛筆從患病煙株上挑取40～50頭蚜蟲(chóng)于滅菌的培養(yǎng)皿中，用封口膜封好，室溫下饑餓24 h。將饑餓后的蚜蟲(chóng)以單蟲(chóng)單苗的方式接到健康煙株上進(jìn)行傳毒試驗(yàn)，飼毒24 h后滅蟲(chóng)。2批處理共接種40株煙株，待接種植株產(chǎn)生癥狀后，對(duì)無(wú)癥狀接種煙株進(jìn)行TBTV、 TVDV、TVDVaRNA和 Sat-TBTV的檢測(cè)。

方法B：用毛筆挑取無(wú)毒蚜于滅菌的培養(yǎng)皿中，用封口膜封好，室溫下饑餓2～4 h。再將蚜蟲(chóng)接到煙草叢頂病自然發(fā)病的煙株上飼毒48 h，然后按單蟲(chóng)單苗的方式將飼過(guò)毒的蚜蟲(chóng)接到健康煙株上進(jìn)行傳毒試驗(yàn)，24 h后滅蟲(chóng)。8批處理共接種212株煙株，待接種植株產(chǎn)生癥狀后，隨機(jī)挑取無(wú)癥狀接種植株進(jìn)行TBTV、 TVDV、TVDVaRNA和 Sat-TBTV的檢測(cè)。

方法C：挑取無(wú)毒蚜蟲(chóng)于煙草叢頂病自然發(fā)病的煙株上取食48 h，之后將蚜蟲(chóng)按單蟲(chóng)單苗轉(zhuǎn)接到健康植株上傳毒24 h，此后每隔24 h將蚜蟲(chóng)轉(zhuǎn)接到另一健康煙株上進(jìn)行傳毒，直至蚜蟲(chóng)死亡，7批處理共接種47株煙株，待接種植株產(chǎn)生癥狀后，對(duì)無(wú)癥狀接種煙株進(jìn)行TBTV、 TVDV、TVDVaRNA和 Sat-TBTV的檢測(cè)。

1.6 煙草叢頂病4種病原物檢測(cè)及鑒定

接種植株總RNA的提取參照TRIpure Reagent產(chǎn)品的步驟進(jìn)行。RT 反應(yīng)體系參照 TaKaRa 的Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。50 μL PCR反應(yīng)體系包括 1st strand cDNA 0.5 μL， 正反向引物(10 μmol)各2 μL、dNTPs (2.5 mmol)4 μL、TaqDNA 聚合酶(5U/μL)0.25 μL、10×PCR Buffer (Mg2+Plus)5 μL、ddH2O 36.25 μL。PCR 反應(yīng)循環(huán)如下：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)擴(kuò)增35 次；最后72 ℃延伸10 min。

挑取只檢測(cè)到TVDV的PCR產(chǎn)物，采用天根通用型DNA純化回收試劑盒回收目標(biāo)片段，回收產(chǎn)物送深圳華大基因公司測(cè)序，測(cè)序經(jīng)DNASTAR軟件處理后在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TVDV分離結(jié)果

通過(guò)以上3種不同的單蟲(chóng)單苗傳毒方式，只有方法A和方法B分離到了只含TVDV的煙株。方法A接種一周后，其中的28株接種煙株表現(xiàn)出典型的煙草叢頂病癥狀，12株無(wú)癥狀表現(xiàn)(見(jiàn)表2)。隨機(jī)挑取幾株表現(xiàn)煙草叢頂病癥狀的煙株葉片，提取核酸并進(jìn)行4種病原物的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示在表現(xiàn)叢頂癥狀的煙株中都能檢測(cè)到4種病原物，因此直接將表現(xiàn)出叢頂病癥狀的煙株清理掉。采集沒(méi)有明顯癥狀的煙株葉片，提取核酸并檢測(cè)TBTV、 TVDV、TVDVaRNA和 Sat-TBTV。檢測(cè)結(jié)果顯示12株無(wú)癥狀的煙株中有4株只感染了TVDV，另外8株同時(shí)感染了TVDV和TVDVaRNA。對(duì)只檢測(cè)到TVDV和同時(shí)感染了TVDV和TVDVaRNA的煙株用健康蚜蟲(chóng)傳代保存。

表2方法A分離TVDV結(jié)果

Table2ResultsofTVDVisolationinmethodA

處理Treatment發(fā)病時(shí)間/dOccurrencetime蚜傳株數(shù)/株Numberofinoculatedplantsbyaphids出現(xiàn)癥狀株數(shù)/株Numberofdiseasedplants未出現(xiàn)癥狀株數(shù)/株Numberofsymptomlessplants僅檢測(cè)到TVDV株數(shù)/株NumberofplantsonlywithTVDVdetectedⅠ7201643Ⅱ7201281總計(jì)Total4028124

方法B中8批接種的212株煙株中有77株表現(xiàn)出煙草叢頂病癥狀，135株無(wú)癥狀表現(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。從沒(méi)有表現(xiàn)癥狀的135 株煙株中，每一批隨機(jī)挑取幾株，共挑取 31 株煙株提取總核酸，檢測(cè)TBTV、 TVDV、TVDVaRNA和 Sat-TBTV 4種病原物。在這31株中只有1株只檢測(cè)到TVDV，對(duì)只檢測(cè)到TVDV的煙株用無(wú)毒蚜蟲(chóng)傳代保存。

表3方法B分離TVDV結(jié)果

Table3ResultsofTVDVisolationinmethodB

方法C中7批處理接種的47株煙株，其中33株煙株表現(xiàn)出叢頂病癥狀，14株無(wú)明顯癥狀。將未表現(xiàn)癥狀的煙株提取總核酸檢測(cè)4種病原物，檢測(cè)結(jié)果顯示所有未表現(xiàn)癥狀的14株煙株都沒(méi)有檢測(cè)到單獨(dú)感染 TVDV 的煙株(見(jiàn)表4)。該方法沒(méi)有獲得 TVDV 單獨(dú)侵染的植株，但從該試驗(yàn)結(jié)果可以看出，蚜蟲(chóng)獲毒后的最長(zhǎng)持毒期為 9 d，蚜蟲(chóng)一旦獲毒后可以連續(xù)傳毒數(shù)天，偶爾會(huì)出現(xiàn)間歇性不傳毒現(xiàn)象。

表4方法C單株單蟲(chóng)連續(xù)傳毒試驗(yàn)結(jié)果1)

Table4Continuoustransmissionofthefourcasualagentsoftobaccobushytopdiseasestosingletobaccoplantsbysingleaphid

處理Treatment傳毒天數(shù)Daysafterinoculation第1天The1stday第2天The2ndday第3天The3rdday第4天The4thday第5天The5thday第6天The6thday第7天The7thday第8天The8thday第9天The9thday第10天The10thday第11天The11thdayⅠ+++++++++-/Ⅱ-+---/Ⅲ++---/Ⅳ---/Ⅴ++++++-++/Ⅵ++++++-+/Ⅶ+++-+++/

1) “+”表示出現(xiàn)癥狀，“-”表示未出現(xiàn)癥狀，“/”表示蚜蟲(chóng)死亡。
“+”indicates symptoms，“-”indicates symptomless，“/”indicates death of the aphid.

對(duì)比2種獲得單獨(dú)TVDV的分離方法發(fā)現(xiàn)，方法A從兩批傳毒的40株煙株中分離到4株單獨(dú)感染TVDV的煙株，分離到8株同時(shí)感染TVDV和TVDaVRNA的煙株，其余28株煙株都表現(xiàn)出了煙草叢頂病癥狀，說(shuō)明方法A中蚜蟲(chóng)傳播煙草叢頂病復(fù)合病原物的效率非常高。方法B在處理的212株煙株中只有77株出現(xiàn)了煙草叢頂病癥狀，從135株無(wú)癥狀的煙株中隨機(jī)挑取的31株進(jìn)行檢測(cè)，只有1株是只感染了TVDV，表明利用方法B分離獲得單獨(dú)的TVDV的效率不如方法A。方法A操作更為簡(jiǎn)單、試驗(yàn)周期短。

2.2 TVDV在煙株上引起的癥狀

單獨(dú)感染TVDV的煙株沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的叢頂病癥狀，只是在TVDV侵染的早期，靠近葉片主脈附近有輕微皺縮現(xiàn)象，到侵染后期葉片變得細(xì)長(zhǎng)，葉片輕微扭曲。而同時(shí)感染了TVDV和TVDVaRNA的煙株，早期癥狀與單獨(dú)感染TVDV的煙株沒(méi)有明顯的區(qū)別，生長(zhǎng)后期葉片也會(huì)發(fā)生扭曲，但扭曲程度比單獨(dú)感染TVDV的煙株相對(duì)要重。單獨(dú)感染TVDV或同時(shí)感染TVDV和TVDVaRNA的煙株都能正常開(kāi)花結(jié)果，與典型的叢頂病癥狀煙株相比，整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中沒(méi)有出現(xiàn)壞死、葉片變圓、變小及節(jié)間縮短等現(xiàn)象，也不出現(xiàn)叢頂?shù)陌Y狀。說(shuō)明單獨(dú)感染TVDV或同時(shí)感染TVDV和TVDVaRNA的煙株癥狀較輕，對(duì)煙草的生長(zhǎng)影響不大。

3 討論

本文根據(jù)蚜蟲(chóng)傳播TBTV和TVDV的特性，摸索出了2種能分離獲得單一TVDV的方法。對(duì)比方法A和方法B，方法A分離TVDV的效率高，操作相對(duì)簡(jiǎn)單且試驗(yàn)周期短。而方法B雖然能分離到單一的TVDV，但很多傳毒煙株中都檢測(cè)不到煙草叢頂病的4種病原物。TBTV主要在TVDV的幫助下以非持久性的方式進(jìn)行蚜蟲(chóng)傳播，因此蚜蟲(chóng)的獲毒、持毒及傳毒時(shí)間對(duì)蚜蟲(chóng)的傳毒效率有極大的影響。方法B中蚜蟲(chóng)的飼毒時(shí)間不夠長(zhǎng)，可能是導(dǎo)致獲毒率低而使得傳毒效率降低。而方法A中蚜蟲(chóng)在感病煙株上繁殖數(shù)代，飼毒時(shí)間較長(zhǎng)，使得蚜蟲(chóng)體內(nèi)帶毒率達(dá)到相當(dāng)高的水平，容易獲得與病毒有高親和性的蚜蟲(chóng)群體。類(lèi)似的現(xiàn)象在灰飛虱傳播水稻條紋病毒(Ricestripevirus，RSV)中也有報(bào)道[10]。因此即使在傳毒之前將蚜蟲(chóng)饑餓24 h，蚜蟲(chóng)體內(nèi)的帶毒率還是能維持在一定的水平。但由于TBTV主要存在于蚜蟲(chóng)的口針中，在饑餓過(guò)程中隨著蚜蟲(chóng)不斷地向外吐唾液使得TBTV的含量不斷降低，而TVDV可能主要存在于蚜蟲(chóng)的食道中，從而能將TBTV和TVDV分開(kāi)。方法C的設(shè)計(jì)是基于4種病原物在蚜蟲(chóng)體內(nèi)持毒時(shí)間可能存在差異的推測(cè)，希望利用這種差異獲得單一的TBTV、TVDV、Sat-TBTV及TVDVaRNA。雖然這種方法沒(méi)能將4種病原物分開(kāi)，但是從中我們發(fā)現(xiàn)蚜蟲(chóng)一旦獲毒可在數(shù)天內(nèi)連續(xù)傳毒，偶爾會(huì)出現(xiàn)間歇性不傳毒。因此生產(chǎn)上要嚴(yán)防蚜蟲(chóng)的出現(xiàn)，在蚜蟲(chóng)未出現(xiàn)之前即采取防護(hù)措施。

本文的分離方法也獲得了同時(shí)感染TVDV和TVDVaRNA的煙株，但未能獲得單獨(dú)感染TVDVaRNA的植株，TVDVaRNA總是與TVDV共同存在于煙株中，但TVDV可以獨(dú)立于叢頂病的其他病原物而在煙株中復(fù)制增殖。同時(shí)感染TVDV和TVDVaRNA的煙株在癥狀上與單獨(dú)感染TVDV的煙株沒(méi)有特別明顯的差異，唯一不同的是同時(shí)感染TVDV和TVDVaRNA的煙株在開(kāi)花結(jié)果時(shí)期，葉脈扭曲相對(duì)要重，因此我們推測(cè)TVDVaRNA有加重感病煙株葉片扭曲的作用，但這還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。另外還發(fā)現(xiàn)，同時(shí)感染TVDV和TVDVaRNA的煙株在用無(wú)毒蚜蟲(chóng)進(jìn)行傳代保存的過(guò)程中TVDVaRNA有丟失的現(xiàn)象。到目前為止還沒(méi)有TVDVaRNA生物學(xué)功能的相關(guān)報(bào)道，這也為以后的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。通過(guò)以上3種分離方法，我們只獲得了單獨(dú)感染TVDV 的煙株，沒(méi)有獲得單獨(dú)感染TBTV、TVDVaRNA及Sat-TBTV的煙株，也沒(méi)能獲得同時(shí)感染TBTV和Sat-TBTV的煙株。在摩擦接種的煙株中，Sat-TBTV總是伴隨著TBTV出現(xiàn)(數(shù)據(jù)另文發(fā)表)，而在蚜蟲(chóng)傳毒接種的煙株中，TVDVaRNA只在感染TVDV的煙株中出現(xiàn)。由此看來(lái)，TBTD中復(fù)合病原物之間的相互關(guān)系比較復(fù)雜，值得進(jìn)一步研究。因此分離獲得單獨(dú)的TVDV，對(duì)研究煙草叢頂病中多種病原物在侵染煙草及蚜蟲(chóng)傳播中的相互作用就顯得非常重要。同時(shí)這也為分離病原物復(fù)合體中的單一病毒提供了一定的參考。

在自然條件下幽影病毒總是與黃癥病毒復(fù)合侵染引起植物病害[11]。例如胡蘿卜斑駁病毒(Carrotmottlevirus，CMoV)或胡蘿卜擬斑駁病毒(Carrotmottlemimicvirus，CMoMV)與胡蘿卜紅葉病毒(Carrotredleafvirus，CtRLV)復(fù)合侵染引起胡蘿卜雜色矮化病[12]，豌豆耳突花葉病毒2號(hào)(Peaenationmosaicvirus-2，PEMV-2)與豌豆耳突花葉病毒1號(hào)(Peaenationmosaicvirus-1，PEMV-1)復(fù)合侵染引起豌豆耳突花葉病[13]，花生叢簇病毒(Groundnutrosettevirus，GRV)與花生叢簇輔助病毒(Groundnutrosetteassistorvirus，GRAV)復(fù)合侵染引起花生叢簇病[14]，TBTV與TVDV復(fù)合侵染引起煙草叢頂病[1]，而煙草叢頂病也是目前為止我國(guó)唯一報(bào)道的一種由幽影病毒屬成員引起的病害。幽影病毒通常是被輔助病毒編碼的CP異源包裹后通過(guò)蚜蟲(chóng)傳播，因此輔助病毒在病害的發(fā)生及流行中起了重要的作用。但TVDV同其他的輔助病毒不同，不能在TBTV的幫助下進(jìn)行摩擦接種傳播，而其他黃癥病毒如PEMV-1可以在PEMV-2的幫助下從植物的韌皮部進(jìn)入葉肉組織從而可以通過(guò)機(jī)械摩擦接種傳播；另一種黃癥病毒——甜菜西方黃化病毒(Beetwesternyellowsvirus，BWYV)在萵苣小斑駁病毒(Lettucespecklesmottlevirus，LSMV)的存在下也可以有限地通過(guò)機(jī)械摩擦接種傳播[15]。煙草叢頂病病汁液通過(guò)摩擦接種可以分離到僅含TBTV和Sat-TBTV的煙株，這種煙株在癥狀上與典型的煙草叢頂病癥狀極為相似，侵染前期會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的過(guò)敏性壞死現(xiàn)象，隨后長(zhǎng)出的葉片壞死現(xiàn)象逐漸減弱至消失，葉片褪綠變小，側(cè)枝提前萌發(fā)(數(shù)據(jù)另文發(fā)表)。但與典型的煙草叢頂病癥狀不同的是，被TBTV和Sat-TBTV感染的煙株節(jié)間沒(méi)有明顯的縮短現(xiàn)象。因此我們推測(cè)雖然單獨(dú)的TVDV不能引起煙株矮縮，但可能具有與叢頂病其他病原物相互作用后引起植株矮縮的作用。這些都值得開(kāi)展進(jìn)一步的研究加以驗(yàn)證。

[1]Gates L F. A virus causing axillary bud sprouting of tobacco in Rhodesia and Nyasaland[J]. Annals Applied Biology,1962，50：169-174.

[2]Cole J S. Isolation ofTobaccoveindistortingvirusfrom tobacco plants infected with aphid-transmissible bushy top[J]. Phytopathology,1962,52：1312.

[3]Davis D L，Nielsen M T. Tobacco:production，chemistry and technology[M].Oxford：Blackwell Science，1999：196-215.

[4]李凡，陳海如. 云南西部煙區(qū)的一種新的煙草病害——煙草叢枝癥病害[J].植物保護(hù)，2001，27(4)：50-51.

[5]李凡，吳建宇，陳海如. 煙草叢頂病研究進(jìn)展[J]. 植物病理學(xué)報(bào),2005,35(5)：385-391.

[6]Mo X H，Chen Z B，Chen J P. Complete nucleotide sequence and genome organization of a Chinese isolate ofTobaccoveindistortingvirus[J]. Virus Genes,2010,41：425-431.

[7]Andrew M Q K，Michael J A， Eric B C，et al. Virus taxonomy：classification and nomenclature of viruses. Ninth report of the international committee on taxonomy of viruses[C]. New York：Elsevier Academic Press，2012.

[8]Smith K M. Tobacco resette：a complex virus disease[J]. Parasitology，1946，38：121-124.

[9]Dawson W O，Beck D L，Knorr D A，et al. cDNA cloning of the complete genome ofTobaccomosaicvirusand production of infectious transcripts[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1986，83：1832-1836.

[10]李小力. 灰飛虱與RSV親和性相關(guān)的分子標(biāo)記及RSV對(duì)灰飛虱生活力的影響[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[11]李凡，林奇英，陳海如，等. 幽影病毒引起的幾種主要植物病害[J].微生物學(xué)通報(bào)，2006，33(3)：151-156.

[12]Gibbs M J，Ziegler A，Robinson D J，et al.Carrotmottlemimicvirus(CMoMV)，a second umbravirus associated with carrot motley dwarf disease recognized by nucleic acid hybridization[J/OL]. Molecular Plant Pathology On-line，1996. http：∥www.bspp.org.uk/mppol/1996/1111 gibbs.

[13]Steven A，Demler，Deborah G，et al. Replication of the satellite RNA ofPeaenationmosaicvirusis controlled by RNA 2-encoded functions[J]. Journal of General Virology,1994,75：1399-1406.

[14]Taliansky M E，Robinson D J，Murant A F. Groundnut rosette disease virus complex：biology and molecular biology[J]. Advances in Virus Research,2000,55:357-400.

[15]Murant A F，Robinson D J，Taliansky M E，et al. Genus umbravirus[C]∥van Regenmortel M H V, Fauquet C M，Bishop D H L，et al. Virus taxonomy：classification and nomenclature of viruses. Seventh report of the international committee on taxonomy of viruses. San Diego：Academic Press，2000，785-790.

MethodsfortheisolationofTobaccoveindistortingvirusfromtobaccobushytopdiseaseviruscomplex

Liu Fang1,2， Ma Kunling3， Lan Pingxiu4， Miao Yudong2， Li Xiaojing1， Li Fan1

(1.CollegeofPlantProtection,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China; 2.CollegeofAgricultureandBiotechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China; 3.DaliBranchofDaliTobaccoCompany,Yunnan671000,China; 4.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China)

Tobacco bushy top disease (TBTD) is caused by a complex agents comprisingTobaccobushytopvirus(TBTV),Tobaccobushytopvirussatellite-like RNA (Sat-TBTV),Tobaccoveindistortingvirus(TVDV) andTobaccoveindistortingvirus-associated RNA (TVDVaRNA). The roles of each agent played on tobacco for disease symptom development and disease transmission are still unclear. Based on the differences of aphid transmission characteristics among the complex agents, three biological methods were tested to isolate TVDV from tobacco bushy top disease virus complex. In method A, aphids were firstly fed on the diseased tobacco plants for dozens of days to gain the complex pathogens, and then the aphids were starved for 24 h. The single starved aphid was transferred to a single tobacco plant for agent transmission, and the aphids were killed by pesticide 24 h later. In method B, virus-free aphids were firstly starved for 2-4 h, then fed on the diseased tobacco plant for 48 h. The single aphid was transferred to a single plant for agent transmission for 24 h. In method C, virus-free aphids were fed on the diseased plant for 48 h, and then single aphid was transferred to a single healthy tobacco plant for disease complex pathogen transmission for 24 h. The aphid was moved to another healthy tobacco plant every 24 h till the aphid was dead. The results showed that TVDV could be separated by methods A and B from tobacco bushy top disease virus complex, and method A was more simple and effective than method B.No bushy top disease symptoms could be observed from the tobacco plants infected with TVDV except shrinking in the area near the main vein of the leaf. The leaves of the infected plants tended to be longer and thinner, and the upper leaves showed vein-distorting at the later growth stage. The single TVDV isolated by using these methods could provide useful experimental material for studying the interaction among TVDV with other agents of TBTD, with host plants, or transmission vectors. The methods also might provide a guide for aphid-transmitted virus isolation from complex agent.

tobacco bushy top disease； complex agent；Tobaccoveindistortingvirus； aphid； biological isolation

2013-08-07

：2013-09-23

國(guó)家自然科學(xué)基金(30660101)；云南省科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2011HC005)；云南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)(云教科[2011]14號(hào))

S 432.41

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.04.020

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