王玉琴，楊成德，陳秀蓉，薛 莉，蘇建紅

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，

甘肅省馬鈴薯枯萎病(Fusariumavenaceum)鑒定及其病原生物學(xué)特性

王玉琴，楊成德*，陳秀蓉，薛 莉，蘇建紅

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，

中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，蘭州 730070)

對(duì)甘肅省馬鈴薯枯萎病菌進(jìn)行了分離、鑒定及培養(yǎng)特性的研究。結(jié)果表明，該病原菌大型分生孢子鐮刀形，無色，多細(xì)胞，大小為(12.5～30)μm×(2.5～5)μm；小型分生孢子數(shù)量較多，無色，卵圓形或橢圓形，大小為(4.70～12.94)μm×(1.76～2.35)μm；ITS序列分析表明，病原菌與Fusariumavenaceum(JN6317483)親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)到100%，結(jié)合形態(tài)特征鑒定該病原菌為燕麥鐮刀菌(Fusariumavenaceum)。該病原菌在5～40 ℃范圍內(nèi)均可生長，最適溫度為20 ℃；供試的碳、氮源中，果糖和亮氨酸對(duì)該菌菌絲生長有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)，而顯著抑制菌絲生長的是氯醛糖和碳酸銨(P<0.05)；不同類型培養(yǎng)基中，燕麥片培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長有顯著促進(jìn)作用(P<0.05)。

馬鈴薯； 枯萎病； 鑒定； 培養(yǎng)性狀

馬鈴薯作為一種塊莖類糧蔬兼用食品，具有重要的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]。甘肅是我國馬鈴薯主要產(chǎn)區(qū)之一，馬鈴薯在全省各地均有種植，并以中部干旱區(qū)、高寒陰濕二陰區(qū)為中心，形成隴南濕潤山區(qū)至河西灌區(qū)東部連成一片的馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)[3]。近年來，隨著馬鈴薯種植面積不斷擴(kuò)大，病害種類不斷增多，危害逐年加重，嚴(yán)重制約馬鈴薯生產(chǎn)及其加工產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。據(jù)報(bào)道，世界范圍內(nèi)馬鈴薯真菌性病害已有33種，在我國危害較重、造成損失較大的有10余種[4]，2010年在甘肅省馬鈴薯產(chǎn)區(qū)調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)疑似馬鈴薯枯萎病發(fā)生。馬鈴薯枯萎病菌以菌絲體或厚垣孢子隨病殘?bào)w在土壤中或病薯上越冬。翌年病部產(chǎn)生的分生孢子借雨水或灌溉水傳播，從傷口侵入。田間濕度大、土溫高于28 ℃或重茬地、低洼地易發(fā)病[5]。因此，本試驗(yàn)以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征結(jié)合rDNA-ITS序列分析，從分子生物學(xué)水平上明確甘肅省馬鈴薯枯萎病的病原，并且研究了其培養(yǎng)性狀，以期為該病的田間診斷和綜合防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大田癥狀描述及病原分離與純化

在武威市天?？h和定西市對(duì)典型枯萎病癥狀進(jìn)行描述后，采集馬鈴薯莖稈和薯塊帶回實(shí)驗(yàn)室，按照常規(guī)的組織分離法分離病菌，在PSA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，蔗糖15 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 000 mL)上進(jìn)行培養(yǎng)與純化，將純化獲得的菌株黑暗培養(yǎng)，待產(chǎn)孢后進(jìn)行單孢分離，進(jìn)一步純化后移入PSA斜面培養(yǎng)保存?zhèn)溆肹6]。

1.2 致病性測(cè)定

將產(chǎn)孢的供試菌株用無菌水配制成孢子懸浮液(約 106個(gè)/mL)，在室溫條件下，采用灌根法將分生孢子懸浮液均勻澆灌在種有健康新大坪塊莖的滅菌土壤中，3次重復(fù)，以無菌水為對(duì)照。等長出幼苗后，連續(xù)觀察馬鈴薯的發(fā)病情況，形成典型癥狀后，對(duì)病原菌進(jìn)行再分離，按柯赫氏法則確定病原菌[7]。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株培養(yǎng)產(chǎn)孢后，在顯微鏡下觀察分生孢子梗和分生孢子特征，測(cè)定100個(gè)分生孢子的大小，并在顯微鏡下拍照[8]。根據(jù)病原菌形態(tài)特征，參考相關(guān)文獻(xiàn)[9]進(jìn)行病原菌種的鑒定。

1.3.2 rDNA-ITS的擴(kuò)增與序列分析

1.3.2.1DNA的提取

將供試菌株接種于PDB液體培養(yǎng)基中，于25 ℃下培養(yǎng)7～9 d后收集菌絲，充分研磨后，用UNIQ-10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)提取DNA，經(jīng)電泳檢測(cè)具特異性條帶的DNA提取物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.2.2PCR擴(kuò)增

采用通用引物ITS1(5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′)和ITS4(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)。其擴(kuò)增體系為：10×PCR Buffer 5.0 μL，TaqDNA聚合酶(2 U/μL) 1.2 μL，引物ITS1(10mmol/L)和ITS4(10mmol/L)各2.0 μL，dNTP(10mmol/L)3.0 μL， DNA模板(10 ng/μL)2.0 μL，最后用ddH2O定容到50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸5 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min[10]。取0.4 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，委托上海生工生物有限公司進(jìn)行DNA純化和測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫中的ITS區(qū)相關(guān)序列進(jìn)行同源性比較，明確其系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.4 生物學(xué)特性研究

1.4.1 不同溫度對(duì)菌絲生長的影響

采用生長速率法。將已經(jīng)活化好的病原菌用0.4 cm直徑的打孔器切取菌餅，置于PSA平板中央，置于0、5、10、15、20、25、30、35、40 ℃和45 ℃下培養(yǎng)，重復(fù)5次，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并對(duì)所得數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行方差分析。

1.4.2 不同碳氮源對(duì)菌絲生長的影響

在含1%的碳源(葡萄糖、乳糖、D-樹膠醛糖、麥芽糖、氯醛糖、D-半乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露糖、D-木糖、 D-果糖、不加糖)以及在含0.2%葡萄糖的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基中加入0.25%氮源(氯化銨、硝酸銨、碳酸銨、硝酸鈉、L-谷氨酸、尿素、大豆蛋白胨、L-組氨酸、 L-精氨酸、亮氨酸、蛋白胨、甘氨酸、不加氮源)培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株，20 ℃下培養(yǎng)，分別以不加碳氮源為對(duì)照[11]，其他同1.4.1。

1.4.3 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長的影響

在不同培養(yǎng)基(燕麥片、理查固體、麥芽糖、玉米粉、PDA、查彼固體、PSA、麥芽瓊脂、孟加拉紅瓊脂、水瓊脂共10種，參考文獻(xiàn)[6]配制)上培養(yǎng)病原菌，3次重復(fù)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑， 其他同1.4.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀描述

馬鈴薯枯萎病在生長期及貯藏期均可發(fā)病。生長期首先從植株下部葉片出現(xiàn)萎蔫，逐漸向上擴(kuò)展，初期早晚可恢復(fù)，中午萎蔫(圖1-a、b)；植株莖部維管束變褐色，嚴(yán)重時(shí)全株枯死(圖1-c)；塊莖發(fā)病時(shí)，塊莖上多呈現(xiàn)表面斑點(diǎn)，剖開病薯，可看到從蒂部維管束開始變褐色和擴(kuò)展(圖1-d)。貯藏期塊莖發(fā)病癥狀與生長期一致(圖1)。

圖1 馬鈴薯枯萎病癥狀Fig.1 Symptoms of potato wilt

2.2 病原菌的分離及致病性測(cè)定

從多個(gè)發(fā)病薯塊上采用常規(guī)組織分離法分離獲得多個(gè)真菌分離物，但其培養(yǎng)性狀及菌絲形態(tài)均一致，因此合并為一個(gè)真菌分離物。將該真菌分離物的懸浮液接種于種植健康馬鈴薯塊莖的無菌土壤中，經(jīng)連續(xù)觀察，在馬鈴薯生長中后期開始發(fā)病，植株萎蔫(圖2-b)，剖開莖稈，莖稈維管束變褐；切開塊莖，可見其內(nèi)維管束組織變褐(圖2-c、d)，其發(fā)病癥狀與田間癥狀一致(圖2)。從發(fā)病莖稈和塊莖上均可再分離得到與原接種菌株相同的真菌分離物。根據(jù)柯赫氏法則，確定該分離物為馬鈴薯枯萎病的致病菌株。

圖2 病原致病性測(cè)定Fig.2 Pathogenicity test of the pathogen tested

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 病原菌的形態(tài)特征

病原菌在PSA培養(yǎng)基上菌落粉紅色、桃紅色，菌落隆起，繁茂(但非稀疏)，較厚，致密，菌落中部為橙黃色層，四周菌絲白色，菌背紫紅色(圖3-a、b)。分生孢子無色透明，大型分生孢子鐮刀形，稍彎曲，兩端漸細(xì)，具2～5個(gè)隔膜，多為3個(gè)，大小為(12.5～30)μm×(2.5～5)μm；小型分生孢子長橢圓形、腎形，單孢、雙孢，大小(4.70～12.94)μm×(1.76～2.35)μm，數(shù)量較多(圖3-c、d)。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，參考相關(guān)文獻(xiàn)[12-13]，將病原菌初步鑒定為鐮孢屬真菌(Fusariumsp.)。

2.3.2 rDNA-ITS序列分析

提取該病原菌的基因組DNA，經(jīng)電泳檢測(cè)具特異性條帶(圖4)，可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2% 瓊脂糖凝

膠電泳檢測(cè)，以DNA Marker-DL2000為對(duì)照，在500 bp附近有一條明顯的擴(kuò)增條帶，與預(yù)期ITS rDNA目的片段大小相符(圖5)，將該擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工測(cè)序，所得ITS-rDNA序列為553 bp。登錄Internet網(wǎng)(http:∥www.ncbi.nlm.nih gov/blast.cgi)，將菌株的rDNA-ITS基因序列在GenBank中進(jìn)行同源序列比較，該病原菌與GenBank中各菌株F.acuminatum(JX114788)、F.oxysporum(EU520062)、Gibberellaavenacea(GU934530)、F.avenaceum(JN631748)、F.tricinctum(JX179207)、G.avenacea(EU255796)的相似性都在99%以上，下載相似性最高的序列，并用ClustalX(1.8)軟件進(jìn)行多重序列比較后，再用Mega(4.0)軟件采用鄰接法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，該病原菌與燕麥鐮孢菌(F.avenaceum)(JN631748)聚在一起(圖6)，即其親緣關(guān)系最近，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，進(jìn)一步鑒定其為燕麥鐮孢菌(Fusariumavenaceum)。

圖3 病菌形態(tài)特征Fig.3 Morphological characters of the pathogen

圖4 DNA的提取Fig.4 DNA extraction

2.4 病原菌的生物學(xué)特性

2.4.1 溫度對(duì)菌絲生長的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明(圖7)，病原菌在5～40 ℃范圍內(nèi)均可生長，20 ℃時(shí)菌落生長速率顯著高于其他溫度處理(P<0.05)，為最適生長溫度，5～20 ℃之間隨溫度增加菌絲生長速率增加，高于20 ℃，菌落生長速率逐漸下降，在0 ℃和45 ℃下均不能生長。

2.4.2 碳源對(duì)菌絲生長的影響

表1表明，以果糖為碳源菌絲生長最快，其次為木糖、麥芽糖、甘露糖，4種碳源間無顯著差異，但均顯著高于其他碳源(P<0.05)，且麥芽糖、甘露糖與D-半乳糖差異極不顯著(P<0.01)；菌絲生長速度最慢的是氯醛糖，氯醛糖與蔗糖、可溶性淀粉和CK差異不顯著(P<0.05)，且與乳糖、樹膠醛糖、CK、可溶性淀粉、蔗糖差異極不顯著(P<0.01)。

圖5 ITS-rDNA序列的擴(kuò)增Fig.5 PCR product of ITS-rDNA

圖6 病原菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of Fusarium sp.based on the sequences of 16S rDNA

圖7 溫度對(duì)菌絲生長的影響Fig.7 Effects of temperature on mycelial growth of Fusarium avenaceum

2.4.3 氮源對(duì)菌絲生長的影響

表1表明，與對(duì)照相比，亮氨酸對(duì)該菌菌絲生長有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)；氯化銨、硝酸銨、硝酸鈉對(duì)菌絲生長也有促進(jìn)作用，但與對(duì)照差異不顯著。大豆蛋白胨、蛋白胨、L-谷酸氨、甘氨酸、L-組氨酸、L-精氨酸、尿素、碳酸銨對(duì)該菌的生長有抑制作用，其中碳酸銨，尿素顯著抑制該菌生長(P<0.05)，但尿素與L-精氨酸的差異不顯著(P<0.05)，且與L-精氨酸、L-組氨酸、甘氨酸的差異極不顯著(P<0.01)。

表1不同碳、氮源對(duì)菌絲生長的影響

Table1Effectsofcarbon-sourceandnitrogen-sourceonthemycelialofFusariumavenaceum

碳源C?source菌落直徑/cmColonydiameter氮源N?source菌落直徑/cmColonydiameterD?果糖D?fructose7．72aAD?木糖D?xylose7．43aA麥芽糖Maltose7．36aAB甘露糖Mannose7．35aABD?半乳糖D?galactose5．84bBC葡萄糖Glucose5．80bC乳糖Lactose5．47bcCDD?樹膠醛糖D?gummose5．31bcCDCK(不加糖)5．15bcdCD可溶性淀粉Solublestarch4．78bcdCD蔗糖Sucrose4．45cdCD氯醛糖Chloralose4．03dD亮氨酸Leucine8．04aA 氯化銨Ammoniumchloride7．36abAB硝酸銨Ammoniumnitrate7．27abAB硝酸鈉Sodiumnitrate7．04abcABCK6．88bcAB大豆蛋白胨Soybeanpeptone6．16bcdBC蛋白胨Peptone6．08cdBCL?谷氨酸Glutamicacid5．22deCD甘氨酸Glycine5．01deCDEL?組氨酸L?histidine5．00deCDEL?精氨酸L?arginine4．36efDE尿素Urea3．57fE碳酸銨Ammoniumcarbonate0．4gF

1) 標(biāo)小寫字母者表示在P<0.05水平差異顯著，標(biāo)大寫字母者表示在P<0.01水平差異顯著。下同。 The different letters indicate significance atP<0.05 andP<0.01 levels in different media forFusariumavenaceum.The same below.

2.4.4 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長的影響

從表2可知，不同培養(yǎng)基上菌落的生長速率依次為：燕麥片>理查固體>麥芽糖>玉米粉>PDA>查彼固體>PSA>麥芽瓊脂>孟加拉紅瓊脂>水瓊脂，且在燕麥培養(yǎng)基上菌落的生長速率顯著高于其他培養(yǎng)基(P<0.05)，即燕麥片培養(yǎng)基有利于該病原菌菌絲的生長；菌絲在水瓊脂培養(yǎng)基上生長速率顯著低于其他培養(yǎng)基(P<0.01)。

表2不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長的影響

Table2EffectsofmediaonmycelialgrowthofFusariumavenaceum

培養(yǎng)基Medium菌落直徑/cmColonydiameter培養(yǎng)基Medium菌落直徑/cmColonydiameter燕麥片Oatmeal7．87aA理查固體Richardsolid6．84bAB麥芽糖Maltose6．80bAB玉米粉Maizemedium6．44bcBCPDA6．26bcdBC查彼固體Czapekmedium5．55cdeBCDPSA5．34deCDE麥芽瓊脂Maltagar4．82efDE孟加拉紅瓊脂Rosebengalagar4．24fEF水瓊脂Wateragar3．05gF

3 討論

據(jù)Rakhimov和Khakimov報(bào)道[14]，馬鈴薯枯萎病是由鐮刀菌的5 個(gè)不同種引起的，即茄病鐮刀菌[Fusariumsolani(Mart.)]、尖孢鐮刀菌(F.oxysporumSchl.)、串珠鐮刀菌(F.moniliformeSheld.)、雪腐鐮刀菌[F.nivale(Fr.)Ces.]、接骨木鐮刀菌(F.sambucinumFuck.)。彭學(xué)文等[15]報(bào)道，河北省馬鈴薯枯萎病是由茄病鐮刀菌(F.solani)、串珠鐮刀菌(F.moniliforme)以及尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)引起的。薛玉鳳等[16]報(bào)道，內(nèi)蒙古地區(qū)發(fā)現(xiàn)的馬鈴薯枯萎病病原菌有尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、茄病鐮刀菌(F.solani)和三線鐮刀菌[F.tricinctum(Fr.)Sacc.]。王曉麗等[17]對(duì)馬鈴薯枯萎病初侵染來源及栽培與發(fā)病的關(guān)系進(jìn)行了研究，得到合理施肥均能延緩植株發(fā)病，采用覆膜起壟栽培可以有效降低病薯率。但是，為有效控制馬鈴薯枯萎病的發(fā)生，必須清楚引起病害發(fā)生的病原菌種類，以及發(fā)病條件，進(jìn)而制定有效的防治措施。

本試驗(yàn)通過病原分離、致病性測(cè)定以及形態(tài)學(xué)鑒定、ITS序列分析等方法，將分離自武威市天?？h和定西市的馬鈴薯枯萎病菌鑒定為燕麥鐮刀菌，此為首次報(bào)道該種可以引起馬鈴薯枯萎病。生物學(xué)研究表明，該病原菌能夠在5～40 ℃條件下生長，生長的最適溫度為20 ℃，溫度過高或過低對(duì)菌絲生長均不利，此結(jié)果可為該病害的防治提供理論依據(jù)。該病原菌的菌絲在5～10 ℃條件下均可緩慢生長，但差異不顯著，此結(jié)果說明在貯藏條件下，馬鈴薯枯萎病仍有可能發(fā)病，為馬鈴薯貯藏期病害防治提供了一定依據(jù)。

不同碳、氮源對(duì)菌絲生長的影響存在顯著差異。在供試碳氮源中，最佳碳源是果糖和木糖、麥芽糖、甘露糖，最佳氮源是亮氨酸，氯化銨、硝酸銨、硝酸鈉對(duì)菌絲生長也有促進(jìn)作用，但差異不顯著，碳酸銨、尿素、L-精氨酸抑制該病原菌的生長。根據(jù)不同碳、氮源對(duì)菌絲生長的影響，在實(shí)際生產(chǎn)中可以使用對(duì)病原菌生長有顯著抑制作用的碳氮源作為肥料，減緩病害的發(fā)生。

馬鈴薯枯萎病病原方面僅王麗麗[2]報(bào)道了新疆烏昌地區(qū)有該病害發(fā)生，本文首次確認(rèn)了燕麥鐮刀菌可以引起馬鈴薯枯萎病，并詳細(xì)研究了其生物學(xué)特性，為該病害的田間診斷和綜合防治提供了依據(jù)。

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IdentificationofpotatowiltcausedbyFusariumavenaceumandthebiologicalcharacteristicsofitspathogen

Wang Yuqin，Yang Chengde，Chen Xiurong，Xue Li，Su Jianhong

(CollegeofGrassland,GansuAgriculturalUniversity;KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation;PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince;Sino-U.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

The pathogen causing potato wilt were isolated and identified by the rDNA-ITS sequences and biological characteristics in Gansu Province.The results showed that the macroconidia were hyaline, sickle-shaped, multi-cellular, and the size was (12.5-30)μm × (2.5-5)μm.The microconidia were oval, and the size was (4.70-12.94) μm×(1.76-2.35)μm.The rDNA-ITS sequence of the pathogenic fungus shared 100% similarity with that ofFusariumavenaceum(JN6317483).The morphologic characteristics and ITS sequence analysis all indicated that the pathogenic fungus wasF.avenaceum.The suitable culture temperature was from 5 ℃ to 40 ℃, and the optimum was 20 ℃.D-fructose and leucine had significant promoting effect on the growth of the mycelia (P<0.05), and chloralose and ammonium carbonate significantly inhibited mycelial growth (P<0.05).Oatmeal medium played a significant role in promoting mycelial growth (P<0.05).

potato；Fusariumwilt； identification； culture characteristics

2013-04-11

： 2013-06-17

甘肅省農(nóng)牧廳項(xiàng)目

S 435.32

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.008

* 通信作者 E-mail:yangcd@gsau.edu.cn