連 帆， 王 于， 李家平， 吳錫文， 謝俊聰， 吳澤深， 劉冠琪， 許韓師， 梁柳琴， 楊岫巖， 楊建勇

(中山大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科， 2附屬第一醫(yī)院腫瘤介入科， 3中山醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510080)

自身免疫性肝炎是由自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的慢性進(jìn)行性肝臟炎癥性疾病，病因未明，但嚴(yán)重病例可快速進(jìn)展為肝硬化和肝衰竭[1-4]。自身免疫性肝炎的可能發(fā)病機(jī)制是：在遺傳易感性基礎(chǔ)上，機(jī)體免疫耐受機(jī)制破壞，產(chǎn)生針對(duì)肝臟自身抗原的免疫反應(yīng)，從而破壞肝細(xì)胞導(dǎo)致肝臟炎癥壞死。

法尼酯衍生物X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)是激素核受體超家族中的一種膽汁酸受體，主要在肝腸系統(tǒng)等組織器官表達(dá)，在膽汁酸代謝及膽固醇代謝中發(fā)揮重要作用[5-7]。近年來(lái)有研究指出，F(xiàn)XR在自身免疫性疾病中有其獨(dú)特的抗炎和調(diào)節(jié)免疫的作用。

促甲狀腺素胚胎因子(thyrotropin embryonic factor，TEF)是亮氨酸拉鏈 (leucine zipper，bZIP) 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。最初發(fā)現(xiàn)其在胚胎發(fā)育時(shí)期的腺垂體表達(dá)，后發(fā)現(xiàn)在小鼠的腦、肺、腎、膀胱和消化道中也表達(dá)，而在肝臟中的表達(dá)呈晝夜節(jié)律性[8-10]。Cavadini等[11]發(fā)現(xiàn)肝臟TNF-α表達(dá)增加時(shí)TEF表達(dá)下降，間接提示TEF對(duì)于炎癥損傷具有保護(hù)作用。

本研究旨在觀察FXR和TEF在伴刀豆球蛋白A(concanavalin A, Con A)誘導(dǎo)的肝炎(Con A-induced hepatitis, CIH)小鼠肝損害中的作用，探討FXR-TEF通路改善自身免疫性肝炎的肝功能和減少炎癥反應(yīng)的部分可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)分組和動(dòng)物模型的建立

野生型雄性C57BL/6(5～7 周)小鼠50只購(gòu)自上海斯萊克公司。動(dòng)物飼養(yǎng)恒溫于25 ℃環(huán)境，自由攝水，12 h交替照明。以Con A(購(gòu)自Sigma)用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)稀釋至濃度2.5g/L，采取尾靜脈注射方式，劑量為20 mg/kg，對(duì)照組注射等體積PBS。

FXR的激活方法：野生型雄性C57BL/6(5～7 周)小鼠，隨機(jī)分為2組，分別為空白處理組和實(shí)驗(yàn)組，在注射Con A前分別以普通飼料和1%鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)喂養(yǎng)1周。

2 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)

2.1小鼠肝功能檢測(cè) 在注射Con A后0 h、4 h、8 h、12 h、16 h和24 h尾靜脈取血，離心收集血漿，檢測(cè)肝酶學(xué)指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)。肝酶檢測(cè)在全自動(dòng)生化儀(Hitachi 7600；Tokyo)上完成。

2.2炎癥細(xì)胞因子測(cè)定 在注射Con A后0 h、4 h、8 h、12 h、16 h 和24 h取血，離心收集血漿，按照Bio-Plex Suspension Array系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)流程檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素2(interleukin 2，IL-2)和IL-4。多細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)儀器(Bio-Plex 200)均為Bio-Rad產(chǎn)品。嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)流程來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并得到結(jié)果。板內(nèi)分析變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)≤15%，板間分析CV≤25%；標(biāo)準(zhǔn)品及樣本回收率為70%～130%；樣本中目標(biāo)檢測(cè)物線性圖的R2值高于0.95，與標(biāo)準(zhǔn)品曲線的斜率差均≤25%。

2.3qRT-PCR 內(nèi)參照為β-actin，利用Trizol-氯仿-異丙醇法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，加入上、下游引物和SYBR預(yù)混液等共20 μL(Applied Biosystems)，反應(yīng)體系在ABI PRISM TM7700 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如下：FXR上游引物5’-CCCTGCTTGATGTGCTCAA-3’，下游引物5’-GTGTCCATCACTGCACATCC-3’;TEF上游引物5’-ACCATCTTCCTCTACTGCCATCTTTCAG-3’，下游引物5’-GTACTTGGTCTCGTACTTGGACACGATG-3’；β-actin上游引物5’-CAGCTGAGAGGGAAATCGTG-3’，下游引物5’-CGTGCCAATAGTGATGACC-3’。

2.4Western blotting檢測(cè)FXR、TEF蛋白表達(dá)的變化 取-80 ℃保存的肝臟組織提取蛋白后，以BCA法測(cè)定蛋白濃度，制備上樣蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后以5%脫脂奶粉封閉1 h，以0.3% TBST洗膜3次，加入FXR和TEF I抗，4 ℃恒溫孵育過(guò)夜，再以0.1% TBST洗膜3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的II抗，在室溫下孵育1 h，洗膜，以ECL化學(xué)發(fā)光法曝光。內(nèi)參照為β-actin。

2.5肝臟組織學(xué)檢測(cè) 小鼠肝臟固定脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片行HE染色。免疫組織化學(xué)檢測(cè)：脫蠟后0.3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，微波爐抗原熱修復(fù)。10%山羊血清封閉。加入FXR和TEF I抗(Santa Cruz)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗3次，加入II抗，室溫孵育，PBS洗3次。DAB顯色后，蘇木素復(fù)染，脫水、中性樹(shù)膠封片。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，兩組比較采用Student’st-test；多組間比較采用One-way ANOVA，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 FXR在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎小鼠中低表達(dá)

應(yīng)用qRT-PCR、Western blotting和免疫組織化學(xué)等方法，分別檢測(cè)正常對(duì)照與Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎C57BL/6小鼠肝臟組織中FXR的表達(dá)，結(jié)果顯示FXR在Con A組小鼠中低表達(dá)，見(jiàn)圖1。

Figure 1. FXR expression detected by qRT-PCR (A，n=8), Western blotting (B，n=9), and IHC (C，n=9) in the liver specimens of control (PBS) mice and CIH mice. Mean±SD.*P<0.05 vs PBS.

2 FXR激活對(duì)TEF表達(dá)的影響

應(yīng)用qRT-PCR和Western blotting方法，分別監(jiān)測(cè)喂飼正常食物與喂飼1% CDCA的C57BL/6小鼠肝臟組織中TEF的表達(dá)，結(jié)果顯示喂飼1% CDCA激活FXR 的小鼠，TEF表達(dá)上調(diào)，顯示出FXR對(duì)TEF的正調(diào)控作用。在Con A所誘導(dǎo)的CIH小鼠，TEF表達(dá)降低，CDCA激活FXR后，TEF表達(dá)次上調(diào),見(jiàn)圖2。

3 FXR激活改善Con A小鼠肝功能

C57BL/6小鼠在注射Con A后分別在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h和24 h取血，離心收集血漿，檢測(cè)肝酶ALT和AST。結(jié)果顯示Con A可引起肝損傷，肝酶上升峰值出現(xiàn)在12 h，之后逐漸下降。而注射Con A前喂飼1% CDCA激活FXR的小鼠肝酶上升幅度遠(yuǎn)低于喂飼普通食物者，顯示出FXR激活具有改善肝功能的作用,見(jiàn)圖3。

4 FXR激活下調(diào)Con A小鼠炎癥因子

在注射Con A后分別在0 h、4 h、8 h、2 h、6 h和24 h取血，離心收集血漿，檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-4和IL-2。結(jié)果顯示Con A引起炎癥因子分泌增加，注射Con A前喂飼1% CDCA激活FXR的小鼠炎癥因子上升幅度遠(yuǎn)小于喂飼普通食物者，顯示出FXR激活能減少小鼠肝臟炎癥反應(yīng),見(jiàn)圖4。

討 論

法尼酯衍生物X受體是膽汁酸受體的一種，主要在肝腸系統(tǒng)等組織器官表達(dá)，屬于激素核受體超家族的一員，在膽汁酸及膽固醇代謝中發(fā)揮重要作用。但FXR的作用遠(yuǎn)不止于代謝調(diào)節(jié)。近期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR還具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用。我們之前的研究也表明，F(xiàn)XR具有減輕SLE肝臟炎癥損傷的作用[12]。

本研究探討了FXR在自身免疫性肝炎中的作用，并對(duì)其可能的調(diào)控通路進(jìn)行分析。Con A誘導(dǎo)的肝炎是最接近人類自身免疫性肝炎的動(dòng)物模型，Con A能迅速誘導(dǎo)肝臟炎癥發(fā)生，表現(xiàn)出肝酶升高、T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥介質(zhì)如TNF-α及IFN-γ等均明顯升高。

本研究結(jié)果表明FXR在CIH的表達(dá)量較正常C57BL/6小鼠明顯下降。這說(shuō)明FXR在自身免疫性肝炎的發(fā)生發(fā)展中可能是一個(gè)保護(hù)性因素。由圖3可見(jiàn)，F(xiàn)XR激活能明顯降低Con A引起的肝酶升高，顯示其對(duì)CIH的保護(hù)作用。

在CIH中，多種免疫細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)，如NK細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞等，有多種炎癥介質(zhì)介導(dǎo)引起肝損害，有研究表明，在自身免疫性肝炎小鼠模型的肝臟和脾臟，TNF-α、IL-2、IL-4和IFN-γ表達(dá)升高[13-14]。

Figure 2. Effects of FXR activation on the expression of TEF at mRNA (A, C) and protein (B, D) levels in the liver specimens of the C57BL/6 mice with different treatments. A, B: control (PBS) mice with or without 1% CDCA; C, D: CIH (Con A) mice with or without 1% CDCA. Mean±SD. n=9 in A and C; n=10 in B; n=11 in D. *P<0.05 vs PBS; #P<0.05 vs Con A.

Figure 3. Activation of FXR decreased serum levels of ALT (A) and AST (B).Mean±SD. n=12. *P<0.05 vs Con A+CDCA.

Figure 4. Activation of FXR suppressed the inflammatory cytokines in Con A -induced hepatitis (CIH)mice. Serum IFN-γ, TNF-α, IL-4 and IL-2 were measured in the CIH mice and the control (PBS) mice in the presence or absence of CDCA at different time points.Mean±SD n=5. *P<0.05 vs PBS or PBS+CDCA; #P<0.05 vs Con A.

本研究中CIH小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)，F(xiàn)XR激活可減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。C57BL/6小鼠被喂養(yǎng)1%CDCA 1周后，F(xiàn)XR可被激活，再注射Con A誘導(dǎo)自身免疫性肝炎，炎癥因子檢測(cè)結(jié)果顯示PBS飼養(yǎng)和CDCA飼養(yǎng)的C57BL/6小鼠中炎癥因子表達(dá)不明顯；而由Con A誘導(dǎo)的CIH則出現(xiàn)明顯增高的炎癥因子表達(dá)，喂養(yǎng)FXR激活劑CDCA的CIH小鼠炎癥因子明顯降低，但仍比非CIH小鼠要高(圖4)。由此，我們推測(cè)，F(xiàn)XR激活能夠緩解CIH炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的肝臟損傷。

為進(jìn)一步深入探討FXR的作用機(jī)制，F(xiàn)XR及其靶基因在調(diào)節(jié)中可能存在某些聯(lián)系，它們可能具有某種相互作用，在自身免疫性肝炎的發(fā)病機(jī)制中共同起作用。TEF是亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。本研究中發(fā)現(xiàn)FXR激活明顯促進(jìn)了TEF的表達(dá)。FXR被CDCA激活后，TEF mRNA水平與FXR呈正相關(guān)，其蛋白表達(dá)也有相應(yīng)的上調(diào)。既往研究也發(fā)現(xiàn)FXR具有抑制細(xì)胞凋亡的作用[12]，而TEF早已被證實(shí)為調(diào)控凋亡的重要轉(zhuǎn)錄因子之一[15]，由此可見(jiàn)FXR-TEF可能通過(guò)抑制CIH肝臟細(xì)胞過(guò)度炎癥凋亡而起保護(hù)作用。

綜上所述，本研究提示，F(xiàn)XR在CIH中具有保護(hù)肝細(xì)胞、減少炎癥因子分泌的作用，激活FXR可能是抑制自身免疫性肝炎的途徑之一，而FXR的保護(hù)作用可能是通過(guò)TEF來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] McFarlane IG. Autoimmune hepatitis: Diagnostic criteria, subclassifications, and clinical features[J]. Clin Liver Dis, 2002, 6(3):605-621.

[2] Manns MP, Strassburg CP. Autoimmune hepatitis: clinical challenges[J]. Gastroenterology, 2001, 120(6):1502-1517.

[3] McFarlane IG. Definition and classification of autoimmune hepatitis[J]. Semin Liver Dis, 2002, 22(4):317-324.

[4] 連 帆，王 于，范文哲，等.經(jīng)肝動(dòng)脈同種異體脂肪干細(xì)胞移植治療小鼠自身免疫性肝炎的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)病理生理雜志，2011, 27(7):1389-1392.

[5] Zhu Y, Li F, Guo GL. Tissue-specific function of farnesoid X receptor in liver and intestine[J]. Pharmacol Res, 2011, 63(4):259-265.

[6] 李 鋒，王吉耀. 法呢醇X受體作用的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)病理生理雜志，2008, 24(10):2072-2076.

[7] 連 帆，王 于，李家平，等. 激活FXR抑制MRL/lpr狼瘡小鼠肝損害的研究[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2013, 29(2):210-213.

[8] Gavriouchkina D, Fischer S, Ivacevic T, et al. Thyrotroph embryonic factor regulates light-induced transcription of repair genes in zebrafish embryonic cells [J]. PLoS One, 2010, 5(9): e12542.

[9] Zhou J, Hoggatt AM, Herring BP. Activation of the smooth muscle-specific telokin gene by thyrotroph embryonic factor (TEF)[J]. J Biol Chem, 2004, 279(16):15929-15937.

[10] Gachon F, Fonjallaz P, Damiola F, et al. The loss of circadian PAR bZip transcription factor results in epilepsy [J]. Genes Dev, 2004, 18(12):1397-1412.

[11] Cavadini G, Petrzilka S, Kohler P, et al. TNF-α suppresses the expression of clock genes by interfering with E-box-mediated transcription[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(31):12843-12848.

[12] Lian F, Wang Y, Chen J, et al. Activation of farnesoid X receptor attenuates liver injury in systemic lupus erythematosus[J]. Rheumatol Int, 2012, 32(6): 1705-1710.

[13] Cao J, Liu FX, Yu MX. Expression of programmed death 1 and its ligands in the liver of autoimmune hepatitis C57BL/6 mice[J]. Chin Med J (Engl), 2009, 122(16): 1941-1946.

[14] Oikawa T, Takahashi H, Ishikawa T, et al. Intrahepatic expression of the co-stimulatory molecules programmed death-1, and its ligands in autoimmune liver disease[J]. Pathol Int, 2007, 57(8):485-492.

[15] Ritchie A, Gutierrez O, Fernandez-Luna JL. PAR bZIP-bik is a novel transcriptional pathway that mediates oxidative stress-induced apoptosis in fibroblasts [J]. Cell Death Differ, 2009, 16(6):838-846.