許永杰，李學(xué)英, 王大忠，羅蔓莉，耿娜娜，鄭 翔

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，貴州 遵義 563099； 2.遵義師范學(xué)院，貴州 遵義 563002)

大鯢(Andriasdavidianus)，俗稱娃娃魚，屬兩棲綱有尾目隱鰓鯢科，我國主要分布在貴州、陜西、湖南等地。其被譽(yù)為“活化石”，具有很高的食用及藥用價(jià)值，被國家列為Ⅱ類重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物。王利峰等發(fā)現(xiàn)大鯢皮膚分泌粘液中含有抗菌肽，能夠在濃度為12～22μg /mL時(shí)具有對(duì)革蘭陰性和革蘭陽性細(xì)菌的抑菌作用[1]。Guo等報(bào)道大鯢粘液提取物具有磷酯酶A2活性，大鯢的粘液和蛻皮是提取DNA的優(yōu)質(zhì)材料[2-3]。從粘液和蛻皮中提取DNA與從肝臟等中提取DNA相比，明顯具有非損傷性的優(yōu)勢[4]。非損傷性取材或其他科學(xué)研究都需要將大鯢人工飼養(yǎng)一段時(shí)間，然而實(shí)驗(yàn)室大多不具備養(yǎng)殖場所具備的水源、食物、氣溫等條件，因此提供實(shí)驗(yàn)室成功飼養(yǎng)大鯢的數(shù)據(jù)和資料顯得很有必要。鑒于此，本文提供了1年實(shí)驗(yàn)室成功飼養(yǎng)大鯢和用于大鯢皮膚粘液和蛻皮收集的基本數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 魚缸(長120 cm，寬45 cm，高30 cm)，BS110S型電子天平(北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，紅水溫度計(jì)(衡水布萊迪儀表有限公司)，F(xiàn)P-1006型增氧機(jī)(西安廣騰電子科技有限公司)，YSD-4G型藥理、生理實(shí)驗(yàn)多用儀(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)，空調(diào)(格力電器股份公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 人工養(yǎng)殖第2代大鯢1條，全長94 cm，體重5.75 kg，雌性，購于貴定錦江娃娃魚有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鯢飼養(yǎng)方法 模擬野生大鯢陰暗的生長環(huán)境，用黑紙將玻璃魚缸全部封閉，魚缸上面搭蓋黑色遮蓋物，使魚缸內(nèi)不見光線。將大鯢小心放進(jìn)魚缸內(nèi)，避免刮擦傷。飼養(yǎng)過程中將大鯢放于安靜的實(shí)驗(yàn)室。養(yǎng)殖用水為在空氣中靜置3 d的自來水，pH值為6.65～7.16，增氧機(jī)增加溶氧量，連續(xù)不斷供氧, 根據(jù)天氣變化的情況和水質(zhì)的混濁度，2～5 d換水一次。根據(jù)大鯢進(jìn)食的情況，2～5d在19∶00～20∶00投餌一次。投飼食物為鯉魚，切為魚塊，攝食量以大鯢8 min未再進(jìn)食為準(zhǔn)，即所投最后魚塊如果大鯢在8 min內(nèi)未被攝食，計(jì)算攝食量為最后一塊之前所攝食魚塊重量。觀察記錄水溫、水質(zhì)、增氧情況和大鯢食量、精神狀態(tài)和排便情況。

1.3.2 電刺激法和背部直接刮擦法 分別以10～50 V電壓多位點(diǎn)刺激大鯢背部皮膚8 min，刺激后10 min收集大鯢粘液，其刺激的時(shí)間點(diǎn)分別為第1、3、6、8、16天。背部直接刮擦法為滅菌朔料三角板在大鯢背部直接稍用力刮擦。

2 結(jié)果

2.1 大鯢生長狀況 在2011年8～9月和10～11月溫度在20～24 ℃，大鯢活動(dòng)量大，反應(yīng)敏捷，攝食次數(shù)分別為14次和16次，總攝食量分別為480.42 g和773.38 g；12月溫度在7～14 ℃，大鯢活動(dòng)量小，反應(yīng)遲鈍，攝食次數(shù)為5次，總攝食量為148.56 g；2012年3～4月溫度在7～24 ℃，隨溫度升高大鯢活動(dòng)量逐漸增強(qiáng)，攝食次數(shù)為14次，總攝食量為363.50 g；5～6月溫度在20～24 ℃，大鯢活動(dòng)性強(qiáng)，攝食次數(shù)為15次，總攝食量為511.12 g；7～8月溫度為22～24 ℃，大鯢活動(dòng)性強(qiáng)，攝食次數(shù)為14次，總攝食量為403.72 g(見圖1)。在適宜溫度范圍(15～22℃)內(nèi)大鯢攝食反應(yīng)靈敏，主動(dòng)攝食，攝食量大；在低溫范圍內(nèi)(7～11 ℃)大鯢攝食反應(yīng)遲鈍，不主動(dòng)攝食，攝食量小。在7～11 ℃大鯢活動(dòng)量小，靜止在水缸中，長時(shí)間不游動(dòng)；在12～14 ℃大鯢活動(dòng)量稍有增加，在水中緩慢游動(dòng)；在15～22 ℃活動(dòng)性最強(qiáng)，在水中快速游動(dòng)。大鯢在水溫為15～22 ℃攝食量大和活動(dòng)度高，反應(yīng)敏捷，生長狀況良好。

2.2 物理刺激法觀察記錄大鯢反應(yīng)

2.2.1 電刺激法觀察大鯢反應(yīng) 在一個(gè)月內(nèi)進(jìn)行電刺激實(shí)驗(yàn)，記錄電壓幅度、時(shí)間及大鯢反應(yīng)等參數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(見圖2)。給予10 V電刺激，大鯢表現(xiàn)出躁動(dòng)不安，皮膚大量脫落，收集到蛻皮3.69 g；給予20～40 V電刺激，大鯢反應(yīng)逐漸更加強(qiáng)烈，躁動(dòng)越來越強(qiáng)，背部弓起，發(fā)怒，有攻擊行為，僅收集到少量蛻皮或未收集到蛻皮；給予50 V電刺激，大鯢發(fā)怒，處于高度防御和進(jìn)攻狀態(tài)，尾部不斷擊打魚缸四壁，產(chǎn)生大量蛻皮。在10～40 V電壓均未收集到粘液，在50 V電壓，大鯢處于高度激惹狀態(tài)，有少量粘液0.2 g。

2.2.2 背部直接刮擦法觀察大鯢反應(yīng) 用滅菌塑料三角板在大鯢背部稍用力來回刮，觀察大鯢反應(yīng)。刮1 min后，見大鯢皮膚分泌粘液，開始為稀薄透明狀，容易從刮板上取下，隨后為粘稠白色粘液，不易從刮板取下。共收集到77.76 g粘液。

2.2.3 電鉆噪音刺激后大鯢反應(yīng) 大鯢在從生態(tài)飼養(yǎng)環(huán)境移到實(shí)驗(yàn)室中的前半月時(shí)間中，躁動(dòng)，不進(jìn)食，且在電鉆噪音下活動(dòng)度加大，且分泌了大量的粘液和蛻皮。經(jīng)過1個(gè)月的時(shí)間，即適應(yīng)了實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。再以電鉆噪音刺激，大鯢無反應(yīng)。

注：圖中精神狀態(tài)、水質(zhì)和增氧得分1，2，3分別表示程度的低，中，高。圖1 實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)大鯢生長狀況

注：圖中粘液量和蛻皮量數(shù)值均擴(kuò)大10倍，以便于趨勢分析。圖2 電刺激大鯢各項(xiàng)數(shù)據(jù)

3 討論

大鯢生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)日臻成熟，養(yǎng)殖業(yè)呈現(xiàn)良好發(fā)展態(tài)勢，生態(tài)飼養(yǎng)數(shù)據(jù)已有報(bào)道，但大鯢的實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)數(shù)據(jù)，未見報(bào)道。沈猷慧等(2000)報(bào)道大鯢喜陰暗怕陽光、喜安靜怕噪音、喜清水怕渾水、喜涼爽怕炎熱和鯢苗喜群居、成鯢喜獨(dú)居等習(xí)性[5]。實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)大鯢，大鯢在7～11℃攝食量小，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)度弱；水溫在15～22 ℃時(shí)攝食量大，活動(dòng)度高，反應(yīng)敏捷，適宜大鯢生長。同沈猷慧等對(duì)野生大鯢生存條件的報(bào)道相一致。

目前，對(duì)大鯢產(chǎn)品的開發(fā)均是宰殺后對(duì)其表皮、肌肉、脂肪等進(jìn)行加工利用，這樣粗放型的利用方法不能充分發(fā)掘大鯢資源的價(jià)值。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，大鯢資源的精深加工利用已經(jīng)成為一個(gè)關(guān)系大鯢產(chǎn)業(yè)能否持續(xù)健康發(fā)展的緊迫課題。針對(duì)大鯢體內(nèi)富含多種天然生物活性物質(zhì)，對(duì)大鯢活性成分進(jìn)行提取、研發(fā)具有高附加值的下游產(chǎn)品如食品、化妝品、保健品、藥品等，可以實(shí)現(xiàn)人工養(yǎng)殖大鯢產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化、市場化和國際化。大鯢皮膚粘液中含有抗菌肽、抗氧化和增強(qiáng)機(jī)體免疫等活性物質(zhì)[1,6]，并且已經(jīng)開發(fā)出“湘鯢”等護(hù)膚品和“仙鯢蔻”系列牙膏產(chǎn)品。如果從剝離的兩棲類皮膚中直接獲得抗菌肽必須處死動(dòng)物，不利于資源的可持續(xù)利用。因此，探索非損傷性、可重復(fù)采集的方式來收集大鯢皮膚粘液進(jìn)行抗菌肽研究是必要的。誘導(dǎo)刺激粘液的方法主要有：微生物誘導(dǎo)法、化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)法(去甲腎上腺素)、物理刺激法(電流刺激和按摩)[7]。Asoodeh等用4～6 V電壓電刺激沼澤蛙，收集蛙類皮膚粘液[8]，而楊國華等發(fā)現(xiàn)中國大鯢表面神經(jīng)丘杯狀托的缺失[9]，故此本課題組推測中國大鯢皮膚表面神經(jīng)丘感受刺激的閾值可能較高，選擇了10～50 V電壓進(jìn)行階梯式電刺激以收集皮膚和體表粘液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除第1次電刺激(10V)的蛻皮量較大(3.69 g)外，之后雖然增加了刺激電壓，蛻皮量未增加，反而大大下降，也未收集到體表粘液；當(dāng)電壓從20V增至50V時(shí)，蛻皮量有一定程度的提高，但仍然低于第1次刺激，體表僅有少量粘液分泌。此時(shí)大鯢已經(jīng)處于極度激怒狀態(tài)，為避免過高電壓對(duì)大鯢機(jī)體可能造成的損傷而沒有進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?？梢姡姶碳?duì)于大鯢皮膚及其粘液的收集不是一種適宜的方法。直接刮擦大鯢背部，觀察到大量粘液分泌，其作用可能相當(dāng)于直接按摩大鯢背部粘液腺和顆粒腺，促使粘液大量分泌，但也有可能是大鯢的防御反應(yīng)。其次，此法操作相對(duì)簡單，可以避免微生物法中需要選擇菌種和掌握接種菌量的弊端。同時(shí)，用直接刮擦法進(jìn)行試驗(yàn)期間，大鯢活動(dòng)度和攝食量無明顯變化，生存狀況良好?？梢娛且环N較好的實(shí)現(xiàn)持續(xù)收集大鯢皮膚粘液的有效方法。此外，大鯢飼養(yǎng)過程中，還觀察到電鉆噪音在首次對(duì)大鯢進(jìn)行干擾時(shí)，也使大鯢皮膚產(chǎn)生大量的粘液。但再次干擾時(shí)未見此現(xiàn)象?？梢?，成年大鯢對(duì)聲音和電刺激均有一定的耐受，對(duì)其生存無太大影響。

綜上所述，通過模擬大鯢生境，可以在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行大鯢的長期飼養(yǎng)，便于對(duì)其取材以進(jìn)行科學(xué)研究。對(duì)于體表粘液的收集來說，直接刮擦法是一種簡單、易行、有效的方法。

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