向 陽，王 寅，李 寧

(云南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，昆明 650500)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)又稱過敏性鼻炎[1]。導(dǎo)師王寅教授經(jīng)過多年的臨床實(shí)踐，認(rèn)為變應(yīng)性鼻炎起病的內(nèi)因主要責(zé)之于肺、脾、腎三臟虛損，其外因則與感受外邪密切相關(guān)，與《金匱要略·血痹虛勞病脈證治第七》中“虛勞諸不足，風(fēng)氣百疾”所述病機(jī)頗有相似之處，遂以薯蕷丸為主方加減治療變應(yīng)性鼻炎[2]。本研究通過觀察變應(yīng)性鼻炎大鼠的癥狀、血清IgE、IL-4含量及鼻黏膜組織形態(tài)學(xué)的變化情況，探討薯蕷丸對變應(yīng)性鼻炎大鼠模型的干預(yù)作用。

1 材料

SPF級SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量(150±20) g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。在空調(diào)動物房常規(guī)飼養(yǎng)，避免過敏原存在。通竅鼻炎片(云南楚雄云中制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn),批號：130101)；辛芩顆粒(四川志遠(yuǎn)廣和藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：130114)；氫氧化鋁(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司制藥廠，批號：80321)；IL-4、IgE試劑盒〔艾萊薩生物科技(上海)有限公司，批號：3646、3640〕；卵清蛋白(Sigma公司，A5253)。 經(jīng)方薯蕷丸：山藥、黨參、白術(shù)、茯苓、干地黃、當(dāng)歸、川芎、白芍、阿膠、柴胡、桂枝、防風(fēng)、燈籠草、杏仁、桔梗、蔓荊子、神曲、大棗、甘草、連翹，以上藥物加水沒過藥物一指，浸泡0.5 h后武火煮沸，文火煎煮20 min，共2次。濾液濃縮至原生藥含量3.2 g/mL，4 ℃冰箱低溫放置備用，每次制備2 d用藥量，濃縮后2 d內(nèi)用完，臨時用蒸餾水稀釋。

Infinite M200酶標(biāo)儀(Tecan公司生產(chǎn));KA-1000型低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠制造)；GHP-9050型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))；RM2235手動輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、HI1210攤片機(jī)、HI1220烘片機(jī)(德國Leica公司生產(chǎn))；Nikon Eclipse 50i顯微鏡(日本)等。

2 方法

2.1 模型建立 SD大鼠70只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為:正常對照組、模型組、通竅鼻炎片組、辛芩顆粒組、經(jīng)方薯蕷丸高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只。根據(jù)文獻(xiàn)方法建立實(shí)驗(yàn)大鼠模型[3-4]，除正常對照組外，每只大鼠腹腔注射新鮮配制的卵清蛋白混懸液(OVA 0.3 mg+氫氧化鋁30 mg+生理鹽水1 mL)隔日1次，共7次，為基礎(chǔ)致敏；再用2%卵清蛋白懸濁液攻擊雙側(cè)鼻腔，每側(cè)50 μL，1次/d，共7次。每次致敏后觀察30 min內(nèi)大鼠噴嚏、抓鼻、流涕行為學(xué)癥狀，記錄大鼠癥狀得分。噴嚏:1～3個計1分，4～10個計2分，11個以上計3分；少量鼻涕計1分，涕過中線計2分，涕流滿面計3分；輕抓鼻數(shù)次計1分,兩者之間計2 分，四處摩擦計3分[5]。積分大于5分為造模成功。

2.2 給藥方法 模型建立成功后，據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[6]“不同動物等效劑量折算系數(shù)表”將成人每日所需用藥量換算成大鼠每日所需藥量。高、中、低劑量組分別給予薯蕷丸濃縮水煎劑(32、16、8 g/kg)灌胃干預(yù)，辛芩顆粒組給藥5 g/kg，通竅鼻炎片組給藥1.8 g/kg，模型組和正常對照組每只給予口飼生理鹽水0.1 mL/kg。連續(xù)干預(yù)14 d。自給藥日起除正常對照組外各組繼予2%OVA懸濁液滴鼻，1次/2 d，滴鼻后30 min內(nèi)記錄行為學(xué)得分。

2.3 指標(biāo)檢測 將大鼠用10%水合氯醛0.03 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈取血4 mL，于室溫下靜置2 h，離心(3 000 r/min)15 min后，取上清液- 20 ℃保存待測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)檢測每組大鼠血清IgE及IL-4含量，按照試劑盒說明書進(jìn)行,于酶標(biāo)儀450 nm波長處讀取OD值，繪制曲線計算血清IgE及IL-4濃度值。大鼠取血后立即將其斷頭處死，并將上頜骨從顱骨中游離出來，沿鼻中線剪開鼻腔，暴露鼻中隔，剝離雙側(cè)鼻中隔黏膜并按組及時固定于10%中性甲醛溶液內(nèi)，4 ℃固定2 h以上。鼻中隔黏膜石蠟包埋，常規(guī)切片行HE染色，光鏡下觀察鼻黏膜組織形態(tài)改變。

3 結(jié)果

3.1 干預(yù)前后行為學(xué)積分變化 從建模初次致敏7 d后進(jìn)行局部抗原攻擊，大鼠搔鼻、噴嚏的次數(shù)、流涕的程度成逐漸增加趨勢，滴鼻14 d后各組大鼠行為學(xué)積分較正常對照組有顯著差異(P<0.01)，提示建模成功；給予藥物干預(yù)14 d后，薯蕷丸高、中、低劑量組、通竅鼻炎片組及辛芩顆粒組行為學(xué)評分均有下降，各組與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，如表1所示。

表1 干預(yù)前后行為學(xué)評分

注：與正常組比較，#P<0.01；與模型組比較,△P<0.01。

3.2 血清總IgE、IL-4含量測定結(jié)果 見表2。

表2 血清IgE、IL-4含量值比較

注：與正常組比較,#P<0.01；與模型組比較,△P<0.01；與辛芩顆粒組比較,▲P<0.05。

3.3 鼻黏膜組織形態(tài)學(xué)觀察 顯微鏡下正常對照組(圖1-a)大鼠鼻黏膜上皮組織及黏膜下組織和腺體結(jié)構(gòu)正常，未見充血、增生性改變及炎癥細(xì)胞浸潤;模型組(圖1-b、c)部分上皮組織脫落，黏膜下組織大量炎細(xì)胞浸潤，水腫、充血，腺體增生；辛芩顆粒組(圖1-g)、通竅鼻炎片組(圖1-h)炎癥細(xì)胞浸潤減輕，仍有部分導(dǎo)管增粗及少量腺體增生；薯蕷丸干預(yù)后高(圖1-d)、低劑量組(圖1-f)組織恢復(fù)較好，仍有少量炎癥細(xì)胞浸潤；中劑量組(圖1-e)上皮及黏膜下組織結(jié)構(gòu)完整，排列均勻，未見明顯腺體增生及炎癥細(xì)胞浸潤，提示對組織形態(tài)修復(fù)效果明顯。

4 討論

鼻塞、鼻癢、噴嚏、流涕是變應(yīng)性鼻炎典型臨床特征[7]，也是I型變態(tài)反應(yīng)在鼻腔的集中表現(xiàn)。因此，上述癥狀的消除和減少是改善Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的客觀體現(xiàn)。近年來研究表明，在變應(yīng)性鼻炎炎癥反應(yīng)過程中，血清IgE水平受多種因素的調(diào)節(jié)，其中輔助性T淋巴細(xì)胞(Th1/Th2細(xì)胞)所分泌細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用尤為重要[8]。Th1細(xì)胞因子主要參與細(xì)胞免疫應(yīng)答,而Th2細(xì)胞因子主要參與體液免疫應(yīng)答。Th1和Th2細(xì)胞之間不同的免疫調(diào)節(jié)作用相互協(xié)調(diào)、相互抑制，通過保持動態(tài)的平衡狀態(tài)維持機(jī)體的正常生理功能[9]。IL-4是Th2細(xì)胞分泌的標(biāo)志性細(xì)胞因子，它在IgE合成過程中具有重要的調(diào)控作用。它不僅能促進(jìn)B細(xì)胞的分泌和增殖,還能促進(jìn)IgE的類別轉(zhuǎn)換，主要是通過誘導(dǎo)胚系的e基因的轉(zhuǎn)錄使B細(xì)胞經(jīng)IgM或IgG朝IgE方向轉(zhuǎn)型[10]。IL-4為IgE的正性調(diào)節(jié)因子，是變應(yīng)性鼻炎患者血清中IgE合成過多的主要原因,所以降低IL-4的含量，減少IgE合成是治療變應(yīng)性鼻炎的有效途徑之一。

圖1 7組大鼠鼻黏膜病理切片H.E染色結(jié)果(×400)

薯蕷丸能顯著降低實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性鼻炎大鼠血清IL-4含量，減少IgE合成，并減輕大鼠鼻黏膜炎癥細(xì)胞浸潤，修復(fù)病變組織，起到抑制變態(tài)反應(yīng)的作用。綜合各項(xiàng)檢測結(jié)果表明，中劑量組療效顯著優(yōu)于其他各組，高劑量藥液過于濃稠導(dǎo)致灌胃困難，消化吸收不足可能是影響其療效低于中劑量組的原因之一。

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