孟 宇，呂 俊，齊世美，陳靠山

(皖南醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)研究室，安徽蕪湖241002)

勃起功能障礙(Erectile Dysfunction，ED)是常見的男性疾病，給患者的生活造成不良影響.有學(xué)者通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)NO在舒張海綿體平滑肌方面起著重要的作用［1-3］.正常陰莖海綿體中，平滑肌占40%～52%，海綿體平滑肌數(shù)量減少，結(jié)締組織增加可導(dǎo)致勃起功能障礙.陰莖勃起過程中海綿體平滑肌發(fā)揮著重要的作用［4-6］.在性刺激下，神經(jīng)信號(hào)通過陰莖海綿體神經(jīng)傳導(dǎo)至陰莖末梢，釋放誘發(fā)陰莖勃起的生物活性因子，使陰莖動(dòng)脈擴(kuò)張和陰莖海綿體平滑肌松弛，陰莖勃起.近年來，對(duì)ED的發(fā)生機(jī)制研究已深入分子水平，而其所需的材料主要是陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞.因此，本實(shí)驗(yàn)研究了大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)的可行性，以期為今后探討ED病治療機(jī)制奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物.SD大鼠20只，雄性，6～7周齡，性成熟，體重(180±10)g，南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖廠.

(2)主要試劑.DMEM(high glucose)，GIBCO 公司；Ⅱ型膠原酶，南京凱基生物；抗生素，南京凱基生物；α-SMA antibody，武漢博士德生物技術(shù)有限公司.

(3)儀器.超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號(hào)為SW-CJ-1FD；CO2培養(yǎng)箱，型號(hào)XD-101；倒置顯微鏡，OLYMPUS公司，型號(hào)CKX4.

1.2 方法

(1)分離細(xì)胞.處死SD大鼠，取出陰莖組織，PBS液沖洗；在超凈工作臺(tái)中將組織剪碎成1～2mm的組織小塊，放于六孔板中，用0.2%Ⅱ型膠原酶消化2h，加入等體積0.25%Trypsin繼續(xù)消化0.5h，在顯微鏡下觀察，當(dāng)基本出現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞時(shí)，用完全培養(yǎng)液及時(shí)終止消化［7］，離心方法去除消化液后，將沉淀用培養(yǎng)液混懸，置于培養(yǎng)瓶中，于5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；24h將未貼壁的細(xì)胞轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)瓶，即為P2，貼壁部分細(xì)胞為P1，以后每隔24h，將未貼壁的細(xì)胞轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)瓶，依次得到P3、P4、P5.

(2)細(xì)胞傳代.細(xì)胞用完全培養(yǎng)液重懸，分瓶培養(yǎng).

(3)平滑肌細(xì)胞的鑒定(免疫細(xì)胞化學(xué)法)［8］.制備細(xì)胞爬片，將爬有細(xì)胞的蓋玻片用PBS洗兩遍，然后加入4%的多聚甲醛固定3h.嚴(yán)格按照免疫組化方法步驟水化，通透，洗滌，滅活酶，洗滌，加一抗，洗滌，加強(qiáng)增劑，洗滌，加酶加二抗，DAB法顯色，封片等，然后在顯微鏡下進(jìn)行觀察.

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞經(jīng)過第3～4d培養(yǎng)，有梭形細(xì)胞從邊緣長出，經(jīng)4～5次傳代后，生長緩慢.由圖版I可知，α-SMA在P1～P5中的表達(dá)量依次降低，大鼠陰莖海綿體經(jīng)消化酶消化后，隨著貼壁時(shí)間的增加，細(xì)胞表達(dá)α-SMA逐漸減少.

2.2 免疫組化鑒定結(jié)果

顯微鏡下有梭形平滑肌細(xì)胞，胞質(zhì)淺黃，可見黃色的肌動(dòng)蛋白表達(dá).α-平滑肌肌動(dòng)蛋白在P1～P5中的表達(dá)量依次降低，大鼠陰莖海綿體經(jīng)消化酶消化后，隨著貼壁時(shí)間的增加，細(xì)胞表達(dá)α-SMA逐漸減少；可判定大鼠陰莖海綿體經(jīng)消化酶消化后，24h內(nèi)貼壁的細(xì)胞(P1)是大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞(圖版I).

圖版I α-SMA在P1～P5中的表達(dá)

3 討論

根據(jù)文獻(xiàn)［9］和陰莖組織的結(jié)構(gòu)，平滑肌細(xì)胞可以用組織塊培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng).組織塊培養(yǎng)法容易掌握，但所需時(shí)間較其他方法長.所以，采用酶消化組織塊法消化分離平滑肌細(xì)胞，加速了細(xì)胞遷出時(shí)間，細(xì)胞貼壁迅速，縮短了培養(yǎng)時(shí)間.由于細(xì)胞貼壁培養(yǎng)時(shí)有成纖維細(xì)胞等其他細(xì)胞混雜，所以采用了差速貼壁法純化細(xì)胞，且由于成纖維細(xì)胞和CCSM形態(tài)具有相似性，故需進(jìn)行CCSM的鑒定，我們用免疫組化方法鑒定，平滑肌細(xì)胞內(nèi)有肌動(dòng)蛋白表達(dá)，隨著傳代次數(shù)的增加和貼壁時(shí)間的延長，平滑肌特異性蛋白α-SMA在P1～P5中的表達(dá)量依次降低，證實(shí)其確采用差速貼壁后細(xì)胞純度明顯提高.實(shí)驗(yàn)用性成熟的SD雄性大鼠進(jìn)行取材，解剖部位清晰，取材方便，但取材要保證無菌操作.因此，本實(shí)驗(yàn)采用膠原酶消化和差速貼壁法進(jìn)行平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)，方法方便，切實(shí)可行，能獲得功能和結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞，為相關(guān)研究提供良好的實(shí)驗(yàn)材料.

［1］李世林，胡禮泉，趙冀騰.髂內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎對(duì)大鼠陰莖海綿組織nNOS神經(jīng)纖維及eNOS表達(dá)的影響［J］.中國男科學(xué)雜志，2004，18(3)：8-10.

［2］Uckert S，Kuthe A，Stief CG，et al.Phosphodiesterase isoenzymes a spharmacological targets in the treatment of male erectile dysfunction［J］.World J.Utol.，2001，19(1)：14-22.

［3］Lin CS，LauA，Tu R，et al.Expression ofthree isoformsof cGMP-bind-ing cGMP-specific PDE5 in human penile cavernosum［J］.Biochem Biophys Res Commun.，2000，268(2)：628-635.

［4］Montorsi F，Salonia A，Deho F，et a1.The ageing male and erectile dysfunction［J］.world J.Uro1.，2002，20(1)：28-35.

［5］Christ GJ，Wang HZ，Venkateswarhu K，et a1.Ion channels and gap junctions：their role in erectile physiology，dysfunction，and future therapy［J］.M Urol.，1999，3(2)：61-73.

［6］李路，劉繼紅，袁彗星，等.勃起功能障礙的研究進(jìn)展-第103屆美國泌尿外科學(xué)會(huì)年會(huì)會(huì)議紀(jì)要［J］.中國男科學(xué)雜志，2010，24(1)：64-66.

［7］段永芳，劉繼紅.家兔陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)方法對(duì)比研究［J］.中國男科學(xué)雜志，2002，16(3)：197-200.

［8］劉波，劉繼紅.海綿體平滑肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)的研究［J］.中國男科學(xué)雜志，2006，20(5)：80-81.

［9］郭應(yīng)祿，辛鐘成.勃起功能障礙的外科治療學(xué)［M］.北京：北京醫(yī)科大學(xué)出版社，2000.