朱海東+謝萍華+黃通新+

摘要：鏡檢觀察菌株菌落及細胞形態(tài)，用正交試驗設計法確定菌株最佳發(fā)酵條件。結(jié)果表明，該菌株與鏈霉菌形態(tài)類似，革蘭氏染色呈陽性，最佳發(fā)酵條件為葡萄糖１５ ｇ／Ｌ，酵母液４０ ｇ／Ｌ，裝液量３０ ｍL／２５０ ｍL，發(fā)酵時間７２ ｈ。所產(chǎn)抗生素對高溫（９５ ℃）具有較高的穩(wěn)定性，在酸性和中性環(huán)境中比較穩(wěn)定。

關鍵詞：菌株；抗真菌抗生素；發(fā)酵工藝

中圖分類號：ＴＱ４６５．２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０14）09－2050-02

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ

Ａ Ｋｉｎｄ ｏｆ Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ

ZHU Hai-dong，XIE Ping-hua，HUANG Tong-xin

(Hangzhou Vocational and Technical College，Hangzhou 310018，China)

Ａｂｓｔｒａｃｔ： The colony and cell morphology of one strain was observed with microscopy. The orthogonal experiment was conducted to confirm the optimal fermentation conditions. The results showed that this strain was similar to Streptomyces on morphology. G+and the optimal fermentation conditions were glucose 15 g/L，yeast powder 40 g/L, loaded liquid 30 ml/250ml， fermentation time 72 h. The antibiotics produced by the actinomyces strain were highly stable in hot temperature（95 ℃）， acidic or neutral environment.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： bacterial straim； antifungal antibiotic； fermentation process

現(xiàn)代醫(yī)學的進步提高了重癥病人的生存幾率，然而由于這些病人的抵抗力較差，易發(fā)生條件致病真菌引起的深部感染［１－４］。本研究從土壤中篩選到一株放線菌Actinormyces Ｓ１，前期試驗證明該菌株的代謝產(chǎn)物能對部分導致深部真菌感染的微生物具有較好的抑制作用。本研究通過試驗了解該菌株的基本生長特點，運用正交試驗優(yōu)化其發(fā)酵工藝條件，并對該抗生素粗提物的相關性質(zhì)進行了研究，為后續(xù)對該菌株的進一步深入研究打下基礎。

１材料與方法

１．１試驗材料

１．１．１試驗菌株由杭州職業(yè)技術學院生物制藥研究所提供。

１．１．２主要培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉２５ ｇ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．４ ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４·７Ｈ２Ｏ １ ｇ、蛋白胨１ ｇ、瓊脂２０ ｇ、１０％土豆汁１ Ｌ（小塊狀土豆１００ ｇ，１ Ｌ水煮沸１ ｈ后過濾定容１ Ｌ，１２１ ℃蒸汽滅菌２０ ｍｉｎ）；平板培養(yǎng)基（ｇ／Ｌ）：高氏一號培養(yǎng)基［５］；指示菌培養(yǎng)基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖４０、蛋白胨１０、瓊脂２０, ｐＨ ５．６, １１５ ℃蒸汽滅菌２０ ｍｉｎ；種子培養(yǎng)基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖１５、硫酸鎂０．５、蛋白胨５、磷酸氫二鉀１、硫酸亞鐵０．０１、碳酸鈣０．４, ｐＨ自然，１２１ ℃蒸汽滅菌２０ ｍｉｎ；原始發(fā)酵培養(yǎng)基組成（ｇ／Ｌ）：葡萄糖１０、酵母粉３０、蛋白胨５、磷酸氫二鉀１、氯化鈉１、碳酸鈣１、接種量為１０％，培養(yǎng)基ｐＨ為６．５，裝液量５０ ｍＬ／２５０ｍＬ三角瓶。

１．２試驗方法

１．２．１菌株生長過程觀察將菌株接種至斜面培養(yǎng)基上，恒溫３０ ℃培養(yǎng)，當菌株生長至２、３、４、５、６ ｄ時，觀察菌落特征，并用印片染色法［６］觀察菌株形態(tài)，用Ｍｏｔｉｃ數(shù)碼顯微鏡觀察，拍攝并記錄其生長過程。

１．２．２發(fā)酵液中抗生素效價測定?。保?ｍL發(fā)酵液１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，取上清液，以白色念珠菌為指示菌株，用生物管碟法［７］測定發(fā)酵液抗菌活性。

１．２．３菌株發(fā)酵條件優(yōu)化在原始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，選擇對培養(yǎng)基中的碳源葡萄糖、氮源酵母粉以及搖瓶裝液量和發(fā)酵培養(yǎng)時間４個因素采用Ｌ９（３４）正交試驗進行優(yōu)化［８］，其中４因素分別為葡萄糖的濃度（ｇ／Ｌ）為５、１０、１５，酵母液的濃度（ｇ／Ｌ）２０、３０、４０，搖瓶裝液量（ｍL）３０、４０、５０，發(fā)酵培養(yǎng)時間（ｈ）６６、７２、７８。

１．２．４抗生素的穩(wěn)定性研究熱穩(wěn)定性試驗。將發(fā)酵上清液置于９５ ℃處理１０、３０、６０、１２０ ｍｉｎ后，測定其抗生素效價。不同ｐＨ條件下的穩(wěn)定性試驗。將發(fā)酵液上清液分為３份，調(diào)節(jié)ｐＨ，使之分別處于酸、中、堿性環(huán)境中，在９５ ℃條件下處理１０ ｍｉｎ后，測定其抗生素效價。

２結(jié)果與分析

２．１菌株生長過程觀察

３０ ℃恒溫培養(yǎng)２ ｄ后，平皿上出現(xiàn)紫色的小型菌落，表面光滑，周圍略微可見稀疏菌絲。鏡檢觀察可見少量氣生菌絲，顏色較深，菌絲粗而長，分支較多。培養(yǎng)３ ｄ后，菌落紫色漸退，顏色趨灰色，表面干燥豐滿，邊緣絨狀菌絲增多。鏡檢發(fā)現(xiàn)氣生菌絲數(shù)量明顯增多，互相纏繞，部分菌絲前端出現(xiàn)白色透明的孢子絲。培養(yǎng)４ ｄ后，菌落明顯增大，顏色為灰色。此時氣生菌絲完全交錯纏繞成團狀，大量菌絲出現(xiàn)白色透明孢子絲，同時可見有少量孢子散落，顏色多呈白色透明。培養(yǎng)５ ｄ后，肉眼可見菌落表面多褶皺突起或顆粒，顏色灰色。鏡檢觀察到大量孢子形成，形成串狀或散落成顆粒，具深色。培養(yǎng)６ ｄ后，孢子散開成單個，或２個甚至多個呈鏈狀排列，孢子形狀多為橢圓或圓形，顏色深色，菌絲已經(jīng)完全消失。由此可知該菌株斜面生長至６ ｄ后完全成熟，其菌落和細胞形態(tài)上與鏈霉菌屬放線菌相似。革蘭氏染色結(jié)果顯示菌株為陽性菌。

２．２菌株發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化

根據(jù)Ｌ９（３４）正交表對發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行試驗優(yōu)化，結(jié)果及數(shù)據(jù)處理見表１。由表１可知，當葡萄糖為１５ ｇ／Ｌ，酵母液４０ ｇ／Ｌ，裝液量３０ ｍＬ／２５０ ｍＬ，發(fā)酵培養(yǎng)時間保持在７２ ｈ時，菌株的發(fā)酵效價最高。按照該發(fā)酵組合進行重復試驗３次，發(fā)酵液抑菌圈平均直徑為２．１８ ｃｍ，優(yōu)化結(jié)果符合預期。

由ｒ值可知，以上４個因素對發(fā)酵效價的影響程度由大到小依次為酵母液濃度、裝液量、發(fā)酵培養(yǎng)時間、葡萄糖濃度，因此在后續(xù)的進一步發(fā)酵優(yōu)化時，可重點考慮對結(jié)果影響較大的一些因素。

２．３抗生素穩(wěn)定性分析。

１）熱穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)顯示，當離心分離后的發(fā)酵液處于９５ ℃高溫處理１０、３０、６０、１２０ ｍｉｎ時，所對應的抗生素對指示菌所產(chǎn)生的抑菌圈直徑分別為２．１６、２．１３、１．９６、１．８９、１．７６ ｃｍ。以上數(shù)據(jù)表明，該抗生素在９５ ℃條件下隨時間的延長，抑菌效價的下降并不明顯，常溫下抑菌直徑為２．１６ ｃｍ，即使９５ ℃高溫處理１２０ ｍｉｎ，抑菌圈直徑仍有１．７６ ｃｍ，說明該抗生素對熱具有較高的穩(wěn)定性。試驗過程發(fā)現(xiàn)，該發(fā)酵上清液在高溫下出現(xiàn)混濁現(xiàn)象，主要是蛋白質(zhì)等物質(zhì)發(fā)生了變性并沉淀，預示可以采用高溫法去除發(fā)酵液中的部分蛋白質(zhì)等物質(zhì)。

２）抗生素在酸、中、堿性環(huán)境中的穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)顯示，發(fā)酵液處于原液狀態(tài)時該抗生素對指示菌的抑菌圈直徑為２．１４ ｃｍ，當改變發(fā)酵液ｐＨ為４、７、９時，抑菌圈直徑分別為２．１１、２．１０、０．８０ ｃｍ。以上數(shù)據(jù)表明，當發(fā)酵上清液的ｐＨ為酸性和中性時，雖經(jīng)高溫處理，但該抗生素的抑菌效價變化很微?。欢敯l(fā)酵上清液的ｐＨ為堿性時，該抗生素效價急劇下降，抑菌圈直徑由原液的２．１４ ｃｍ下降到０．８０ ｃｍ，說明該抗生素在酸性和中性環(huán)境中比較穩(wěn)定，而在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定。試驗過程發(fā)現(xiàn)，當發(fā)酵上清液在酸性條件下高溫處理１０ ｍｉｎ后，溶液濁度要大于其他條件；當處于中性條件時，發(fā)酵上清液與其他條件相比最清澈， 這個現(xiàn)象可能與發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)變性有關，而且這些蛋白質(zhì)在酸性條件下更易變性。這種現(xiàn)象預示著在對發(fā)酵液進行預處理時，可以通過改變其酸度來達到除去部分蛋白質(zhì)的目的。

３小結(jié)與討論

本試驗對篩選獲得的一株產(chǎn)抗真菌抗生素的菌株進行了初步研究。菌落和細胞形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)，該菌株與鏈霉菌屬相似，斜面培養(yǎng)至６ ｄ菌株完全成熟。采用正交試驗設計法對該菌株的發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，確定了最佳發(fā)酵工藝條件：葡萄糖１５ ｇ／Ｌ，酵母液４０ ｇ／Ｌ，裝液量３０ ｍＬ／２５０ ｍＬ，發(fā)酵時間７２ ｈ?？股胤€(wěn)定性試驗發(fā)現(xiàn)，該抗生素具有較高的耐熱性，并在酸性和中性環(huán)境下具有相對較高的抑菌活性， 表明該菌具有一定的應用潛力。今后將通過系統(tǒng)分類學方法進一步明確該菌株的種屬關系，全面研究該抗生素分離純化工藝及其理化性質(zhì)。

參考文獻

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