賴先榮 何新友

HPLC法測(cè)定藏藥巴桑母酥油顆粒中沒食子酸的含量

賴先榮 何新友

目的建立藏藥巴桑母酥油顆粒中沒食子酸的含量測(cè)定方法。方法采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定巴桑母酥油顆粒中沒食子酸的含量，色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠柱Welch Materials，流動(dòng)相為乙腈—0.1%磷酸水溶液(3∶97)，流速為1.0 ml/min；柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，外標(biāo)一點(diǎn)法定量。結(jié)果沒食子酸在0.2～1.6 μg范圍內(nèi)，與峰面積積分值線性關(guān)系良好(n=6)。該方法的平均回收率為98.34%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)為1.62%(n=9)。四批樣品的含量分別是0.3224 mg/g、0.3354 mg/g、0.3288 mg/g、0.3269 mg/g。結(jié)論高效液相色譜法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速，適合于該制劑的質(zhì)量控制。

藏藥； 巴桑母酥油顆粒； 沒食子酸； 高效液相色譜法； 含量測(cè)定

巴桑母酥油丸是藏醫(yī)常用的滋補(bǔ)經(jīng)驗(yàn)方，具有壯陽(yáng)益腎，養(yǎng)心安神，強(qiáng)筋骨的功能，用于心悸失眠、脾胃不和、老年虛弱、經(jīng)絡(luò)不利、肢體僵直、腎虛、陽(yáng)痿不舉、虛損不足癥，由訶子、毛訶子、余甘子、黃精、天冬、西藏棱子芹、蒺藜、喜馬拉雅紫茉莉八種藏藥及酥油、牛奶、白糖、煉蜜等藏醫(yī)特色輔料制成，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下僅有處方、制法、性狀、檢查、功能與主治、用法與用量、規(guī)格等質(zhì)量控制項(xiàng)目[1]，缺乏含量測(cè)定項(xiàng)目。巴桑母酥油顆粒是其改變劑型品種，提高了成品對(duì)溫度的耐候性，其處方劑量與原劑型巴桑母酥油丸一致。

巴桑母酥油顆粒處方中訶子、毛訶子、余甘子用量占總處方量的三分之一以上，其主要指標(biāo)成分為沒食子酸[2]。沒食子酸具有較強(qiáng)的抗腫瘤和抗氧化等作用[3]，其含量測(cè)定方法主要采用高效液相色譜法[2]。本文采用高效液相色譜法，具有快速、靈敏、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，同時(shí)采用自動(dòng)進(jìn)樣器可以減少人為因素影響，其重復(fù)性、精密度良好，測(cè)定結(jié)果可信。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-2010A HT高效液相色譜儀(四元泵、在線真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、智能化柱溫箱、紫外檢測(cè)器)；島津LC Solution色譜工作站；BP211D電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；Q-250型超聲波清洗器(上海必能信儀器制造有限公司)；Lambda 35 UV/Vis Spectrometer(美國(guó)Perkin Elmer公司)。

1.2 試藥

甲醇(分析純，成都科龍化學(xué)試劑公司)、石油醚(60～90℃)(分析純，成都科龍化學(xué)試劑公司)、乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific)、磷酸(85%，分析純，成都科龍化學(xué)試劑公司)、水為去離子水，其它試劑均為分析純。

沒食子酸(含量測(cè)定用，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：110831-200302)。

1.3 樣品來(lái)源

巴桑母酥油顆粒(批號(hào)20110201、20110301、20110302、20110303，由成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院提供，規(guī)格為每袋裝25 g)。

訶子、毛訶子、余甘子用量占總處方量的三分之一以上，其主要指標(biāo)成分為沒食子酸[2]。按巴桑母酥油顆粒的處方比例及制備工藝，制成缺訶子、毛訶子、余甘子的陰性樣品制劑。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱Welch Materials(鉆石)(4.6 mm×250 mm，5 μm，柱號(hào)Wel518425)。流動(dòng)相為乙腈—0.1%磷酸水溶液(3∶97)；流速1.0 ml/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸對(duì)照品適量，置10 ml量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為沒食子酸對(duì)照品溶液貯備液(2 mg/ml)。精密吸取上述沒食子酸對(duì)照品貯備液2.5 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為沒食子酸對(duì)照品溶液(0.2 mg/ml)。

2.3 供試品溶液的制備

取裝量差異項(xiàng)下的樣品適量，研細(xì)，取10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入石油醚(60～90℃)100 ml，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30分鐘，放冷，濾過，棄去石油醚液，殘?jiān)]干溶劑，連同濾紙移入錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)1小時(shí)，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性

按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，對(duì)照品溶液與供試品溶液在相同的保留時(shí)間處有相同的色譜峰，供試品溶液有效峰與雜峰能很好分離，分離度大于1.5，拖尾因子不超過1.05，陰性對(duì)照液與對(duì)照品溶液及供試品溶液在相同的保留時(shí)間處無(wú)相應(yīng)的色譜峰，見圖1-4。

圖1 沒食子酸對(duì)照品紫外光譜掃描圖

圖2 沒食子酸對(duì)照品HPLC色譜圖

圖3 巴桑母酥油顆粒HPLC色譜圖

圖4 巴桑母酥油顆粒陰性樣品HPLC色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述對(duì)照品溶液1.0 μl、2.0 μl、4.0 μl、5.0 μl、6.0 μl、8.0 μl注入色譜儀，測(cè)定峰面積積分值，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品的量(μg)(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得沒食子酸回歸方程Y= 7664116X(r=0.9999)。結(jié)果表明沒食子酸對(duì)照品的量在0.2～1.6 μg在范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液(0.2 mg/ml)5 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積積分值。結(jié)果表明相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)為0.61%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

因沒食子酸見光易發(fā)生變化，要求避光保存[3]，故考察對(duì)照品溶液、供試品溶液在陰暗處室溫密閉放置的穩(wěn)定性。

取對(duì)照品溶液(0.2 mg/ml)，置陰暗處室溫密閉放置，在12小時(shí)內(nèi)的不同時(shí)間間隔取出測(cè)定其峰面積積分值。結(jié)果RSD為0.98%(n=6)，表明在12小時(shí)內(nèi)對(duì)照品溶液穩(wěn)定性良好。

取供試品溶液(批號(hào)20110201)，置陰暗處室溫密閉放置，在12小時(shí)內(nèi)的不同時(shí)間間隔取出測(cè)定其峰面積積分值。結(jié)果RSD為1.10%(n=6)，表明在12小時(shí)內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品(批號(hào)20110201)，按2.3項(xiàng)相同方法分別制備6份供試品溶液，測(cè)定沒食子酸含量，結(jié)果平均含量為0.3224 mg/g，RSD為1.56%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品(批號(hào)20110201)約5.0 g，各精密加入沒食子酸(0.2 mg/ml)對(duì)照品溶液8.0 ml，揮干溶劑，按3.3項(xiàng)相同方法分別制備9份供試品溶液，測(cè)定沒食子酸含量，計(jì)算回收率，平均回收率為98.34%，RSD為1.62%(n=9)。結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.10 陰性樣品測(cè)定

取巴桑母酥油顆粒的陰性樣品(不含訶子、毛訶子、余甘子)，按2.3項(xiàng)相同方法制備陰性樣品供試品溶液，依法測(cè)定，在沒食子酸對(duì)照品相應(yīng)的位置上，未見到相應(yīng)的色譜峰。結(jié)果表明：巴桑母酥油顆粒中其他藥味及輔料不影響沒食子酸的測(cè)定結(jié)果。

2.11 樣品測(cè)定

取本品4批，按2.3項(xiàng)相同方法分別制備供試品溶液，測(cè)定沒食子酸含量，含量分別是0.3224 mg/g、0.3354 mg/g、0.3288 mg/g、0.3269 mg/g(n=2)。

3 討論

由于巴桑母酥油顆粒以酥油作為藏醫(yī)特色輔料(約30%)，酥油熔點(diǎn)為34℃且降低色譜柱的理論塔板數(shù)，根據(jù)沒食子酸極性較大的性質(zhì)并參考文獻(xiàn)[4-5]，首先采用石油醚對(duì)樣品進(jìn)行脫脂處理，再用70%甲醇超聲提取，沒食子酸出峰時(shí)間適宜、峰形對(duì)稱性良好、加樣回收率符合要求，結(jié)果達(dá)到很好的效果。

文獻(xiàn)報(bào)道沒食子酸的含量測(cè)定采用甲醇—磷酸溶液[6]和甲醇—十六烷基三甲基溴化胺-N,N二甲基甲酰胺—磷酸溶液[7]作為流動(dòng)相，但實(shí)驗(yàn)中采用甲醇—磷酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，理論塔板數(shù)偏低，沒食子酸峰形差，且保留時(shí)間過長(zhǎng)；而采用乙腈—磷酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，理論塔板數(shù)達(dá)5000以上，沒食子酸出峰時(shí)間適宜、峰形對(duì)稱、尖銳，分離度較好。

沒食子酸對(duì)照品甲醇溶液在200～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，測(cè)得其在215 nm、272 nm處均有吸收峰、在215 nm有最大吸收峰，比較相同色譜條件下樣品于215 nm和272 nm波長(zhǎng)下的色譜圖：檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm的色譜圖沒食子酸峰可以與其它峰達(dá)到良好的基線分離，且重現(xiàn)性好，陰性無(wú)干擾，峰形良好；在272 nm的檢測(cè)波長(zhǎng)下，供試品溶液的沒食子酸色譜峰分離度不能達(dá)到要求(色譜峰前沿有干擾小峰出現(xiàn)，說明有干擾物質(zhì)在275 nm處吸收值較高、在215 nm處吸收值較低)，峰形較差，因此選擇215 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本試驗(yàn)建立的HPLC法測(cè)定巴桑母酥油顆粒中沒食子酸的含量，色譜峰之間能有效分離，精密度、重復(fù)性及線性關(guān)系好，回收率數(shù)值符合規(guī)定，故認(rèn)為該方法簡(jiǎn)便易行、穩(wěn)定可靠，可提高巴桑母酥油顆粒的質(zhì)量控制水平。

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì)，中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(藏藥第一冊(cè))[S].北京：中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì)，1995：297.

[2]鄭海杰，耿志鵬，馮冠榕，等.高效液相色譜法測(cè)定藏藥多血康中沒食子酸的含量[J].中國(guó)科技論文在線，2009，2(11)：1163-1166.

[3]柯發(fā)敏，張開蓮.沒食子酸的研究進(jìn)展[J].瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，34(4)：440-442.

[4]孫文基，謝世昌.天然藥物成分定量分析[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2002：175.

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(本文編輯：董歷華)

ContentdeterminationofgallicacidinTibetanmedicineBasangmubuttergranulesbyHPLC

LAIXian-rong，HEXin-you.

EthnomedicineCollege，ChengduUniversityofTraditionalChinese.Medicine，Chengdu611137，China

LAIXian-rong，E-mail：laixianrong@163.net

ObjectiveTo establish a content determination method of gallic acid in Tibetan medicine Basangmu butter granules.MethodsThe content of gallic acid in Basangmu butter granules was determined by high performance liquid chromatography (HPLC) , the chromatographic column was Welch Materials C18 , the mobile phase was acetonitrile and 0.1% phosphoric acid water solution at rate 3:97, the flow rate was set as 1.0 ml/min, column temperature was set as 30 ℃, detection wavelength was set as 215 nm, used external standard method.ResultsThe gallic acid concentration had a good linear relation with peak area integral quantity in the range of 0.2～1.6 μg (n=6), the average recovery rate was 98.34%, and relative standard deviation(RSD) was 1.62% (n=9). Four batches content were 0.3224 mg/g, 0.3354 mg/g, 0.3288 mg/g and 0.3269 mg/g respectively.ConclusionThe method had showed high accuracy, reliability and reproducibility, so it can be used in the quality control of the preparation.

Tibetan medicine； Basangmu butter granules； Gallic acid； High performance liquid chromatography； Content determination

四川省高?？蒲袆?chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃(11TD004)；成都中醫(yī)藥大學(xué)藏藥學(xué)特色專業(yè)建設(shè)項(xiàng)目(2012-特色-5)；成都中醫(yī)藥大學(xué)藏藥學(xué)專業(yè)綜合改革項(xiàng)目(2012-專業(yè)-13)；西藏藏醫(yī)學(xué)院藏藥有限公司資助項(xiàng)目

611137 成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院

賴先榮(1971-)，本科，副研究員。研究方向：中藥及民族藥創(chuàng)新藥物的研究與開發(fā)。E-mail:laixianrong@163.net

R29

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.02.008

2013-11-20)