李光超 車念聰 耿建國 王志強(qiáng) 郭新新 趙暉 白辰

加味消渴康對(duì)糖尿病腎病大鼠肝組織細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)調(diào)節(jié)因子表達(dá)的影響

李光超 車念聰 耿建國 王志強(qiáng) 郭新新 趙暉 白辰

目的基于中醫(yī)“肝腎同源”理論，觀察加味消渴康對(duì)糖尿病腎病大鼠肝組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)，Smad-4蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein-4)，基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)和金屬蛋白酶組織抑制劑1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1，TIMP-1)表達(dá)的影響。方法采用單側(cè)腎切除加鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病模型，將造模成功后的50只糖尿病腎病大鼠隨機(jī)分為模型組、西藥組和中藥小、中、大劑量組，每組10只，另選取10只正常大鼠作為正常對(duì)照。其中西藥組予氯沙坦(5.2 mg/kg·d)灌胃，中藥組予加味消渴康灌胃(小、中、大劑量分別為13.125 g/kg·d，26.25 g/kg·d和52.5 g/kg·d)，正常組及模型組每日灌服2 ml蒸餾水，共灌胃12周。各組大鼠于第12周末處死取出肝臟，運(yùn)用ELisa法觀察大鼠肝組織TGFβ1、Smad-4、MMP-9和TIMP-1的表達(dá)。結(jié)果與正常組相比，各組大鼠肝中TGF-β1，Smad-4和TIMP-1表達(dá)明顯升高，而MMP-9的表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，中藥治療后，各組大鼠TGF-β1，Smad-4的表達(dá)與模型組相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而TIMP-1和MMP-9的表達(dá)則分別具有降低和升高的趨勢(shì)。結(jié)論加味消渴康對(duì)DN大鼠的肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

肝腎同源； 糖尿病腎??； 肝損傷； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1； 基質(zhì)金屬蛋白酶9； 金屬蛋白酶組織抑制劑-1

中醫(yī)理論認(rèn)為肝與腎的關(guān)系密切，即“肝腎同源”。“肝腎同源”是指肝腎雖然有不同的結(jié)構(gòu)和功能，但其起源相同,生理病理密切相關(guān),常采用“肝腎同治”的治療法則[1]。糖尿病腎病( diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的并發(fā)癥，其主要病因是糖尿病所致的腎小球微血管病變引起的蛋白排泄和濾過異常，其特征是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellu-lar matrix，ECM)在腎小球基底膜的積聚，導(dǎo)致腎小球硬化。在疾病發(fā)生發(fā)展的過程中，由轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)及其Smad蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein)所組成的TGF-β/Smad通路對(duì)ECM的合成起到了重要的作用，與DN的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。與此同時(shí)，在肝損傷發(fā)生時(shí)，該通路也可以發(fā)生相應(yīng)的改變。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可以通過TGF-β/Smad通路激活肝星狀細(xì)胞，進(jìn)而使肝中ECM合成增加，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶/金屬蛋白酶組織抑制劑(matrix metalloprotein-ase/tissue inhibitor of metalloproteinases，MMPs / TIMPs)在臟器纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，其中MMP-9和TIMP-1則尤為重要。MMP-9主要參與ECM的降解，調(diào)節(jié)生理和病理狀態(tài)下ECM的合成和代謝平衡。而TIMP-1作為其抑制劑可以與MMP-9特異性結(jié)合，進(jìn)而阻斷MMP-9的活性。研究顯示，在糖尿病腎病中，MMP-9蛋白及基因表達(dá)明顯降低，TIMP-1蛋白及基因表達(dá)明顯升高[3]。而在肝臟中，各種原因?qū)е碌母螕p傷，尤其是肝纖維化，也會(huì)發(fā)生MMP-9/TIMP-1的調(diào)節(jié)失衡。研究發(fā)現(xiàn)，在免疫性肝纖維化大鼠中，會(huì)出現(xiàn)MMP-9/TIMP-1的比例失衡[4]。基于此，本實(shí)驗(yàn)在中醫(yī)“肝腎同源”理論的指導(dǎo)下，通過觀察加味消渴康對(duì)糖尿病腎病大鼠肝組織TGF-β1，Smad-4，MMP-9和TIMP-1表達(dá)的影響，探討其對(duì)DN大鼠肝臟的保護(hù)作用，為中醫(yī)的“肝腎同源”理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

SD雄性大鼠60只，體重160～180 g，鼠齡2～3月，購自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部[動(dòng)物的合格證號(hào)：SCXK(京)2006-0009]。加味消渴康由生黃芪10 g、山茱萸30 g、生薏苡仁30 g、水蛭6 g、葛根30 g、丹參10 g、決明子10 g組成，所需藥材購自北京祥威藥業(yè)公司；氯沙坦鉀片(購自杭州默沙東制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：100438)，鏈脲佐菌素(購自美國Sigma公司)，大鼠TGFβ-1ELISA試劑盒(購自上海藍(lán)基生物科技有限公司)，大鼠Smad-4 ELISA試劑盒(購自上海藍(lán)基生物科技有限公司)，大鼠MMP-9 ELISA試劑盒(購自上海藍(lán)基生物科技有限公司)；大鼠TIMP-1 ELISA試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型制備及分組

本實(shí)驗(yàn)采用單側(cè)腎切除加腹腔注射鏈脲佐菌素的方法制作DN大鼠模型：將造模大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，行右側(cè)腎臟切除術(shù)。術(shù)后2周，禁食12小時(shí)，按50 mg/kg的劑量進(jìn)行單次腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素。72小時(shí)后，尾靜脈采血，用穩(wěn)步血糖儀測(cè)定大鼠血糖，用尿糖試紙測(cè)大鼠隨意尿糖，血糖濃度≥16.7 mmol/L，尿糖定性>+++，確定DN造模成功[5]。將造模成功的50只大鼠隨機(jī)分為模型組、氯沙坦組(5.2 mg/kg·d)、加味消渴康小劑量組(13.125 g/kg·d)、加味消渴康中劑量組(26.25 g/kg·d)、加味消渴康大劑量組(52.5 g/kg·d)灌胃，此外，另取10只大鼠作為正常對(duì)照組，每日1次，連續(xù)灌胃12周，正常組及模型組每日灌服2 ml蒸餾水。

2.2 標(biāo)本采集和觀察指標(biāo)檢測(cè)

各組大鼠于第12周末進(jìn)行肝臟取材，每只取下150～200 mg肝組織，加入生理鹽水，肝組織重量與生理鹽水量比例為1∶7。在冰浴中制備勻漿后4℃ 3000 r離心20分鐘，取上清液0.1 ml，放入4℃冰箱備用。取出大鼠TGF-β1，Smad-4，MMP-9和TIMP-1 Elisa試劑盒，于室溫(25～30℃)放置30分鐘。取出酶標(biāo)板，按照標(biāo)準(zhǔn)品的次序分別加入50 μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中?？瞻孜⒖字屑尤?0 μl的樣品，空白對(duì)照加入50 μl的蒸餾水。在各孔中加入100 μl的酶標(biāo)記溶液(不含空白對(duì)照孔)。將酶標(biāo)板用封口膠密封后，37℃孵育反映1小時(shí)(在孵育箱中保持穩(wěn)定的溫度與濕度)。充分清洗酶標(biāo)板5次，保持各孔有充足的水壓(濃縮洗滌液以1∶100的比例與蒸餾水稀釋)。酶標(biāo)板洗滌后用吸水紙徹底拍干。各孔加入顯色劑A、B各50 μl后37℃避光反映10～15分鐘。各孔加入50 μl終止液，終止反應(yīng)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組大鼠肝組織TGF-β1與Smad-4表達(dá)的測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠肝組織TGF-β1，Smad-4的比較

注：與正常組相比aP<0.01，bP<0.05與模型組相比cP<0.01，dP<0.05.

與正常組相比，各組大鼠TGF-β1，Smad-4和TIMP-1的含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。而MMP-9的含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，各治療組TGF-β1和Smad-4的含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。而TIMP-1的表達(dá)具有降低的趨勢(shì)，MMP-9的表達(dá)則具有升高的趨勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

4 討論

“肝腎同源”是中醫(yī)的經(jīng)典理論之一，它最早起源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》?！端貑枴り庩枒?yīng)象大論》云：“北方生寒，寒生水，水生咸，咸生腎，腎生骨髓，髓生肝。”本實(shí)驗(yàn)在基于該理論的前提下對(duì)DN大鼠肝臟進(jìn)行了相關(guān)的研究。在此，筆者主要從以下四點(diǎn)進(jìn)行分析。

4.1 肝與腎在生理上關(guān)系密切

肝屬東方甲乙木，主疏泄，調(diào)暢氣機(jī)，調(diào)節(jié)氣血津液的代謝，疏泄情志，肝藏血，以生發(fā)為特性。腎屬北方壬癸水，主閉藏，主水，通過蒸騰氣化調(diào)節(jié)人體水液的代謝，腎藏精，主生長(zhǎng)發(fā)育和生殖。肝腎在生理方面密切相關(guān)，首先，在五行之中，水生木，木為水之子，故肝腎為子母關(guān)系，其氣相通，肝木得到腎水的滋養(yǎng)才能得以維持正常的生理功能。其次，肝藏血，腎藏精，而精血同源，故肝中之血與腎中之精可以相互化生，肝血可以下達(dá)于腎以滋養(yǎng)腎精，使腎精化而有源；同樣肝血也有賴于腎精的滋生。與此同時(shí)，腎藏精，主骨生髓，骨中精髓與血液也可相互化生[6]，此外，肝與腎在經(jīng)脈上的循行上密切相關(guān)，足厥陰肝經(jīng)與足少陰腎經(jīng)都循行于身體內(nèi)側(cè)，并交會(huì)于“三陰交”，同時(shí)也通過奇經(jīng)八脈而相互關(guān)聯(lián)，經(jīng)氣互通。若肝腎的經(jīng)氣不利，勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致肝腎的相關(guān)功能紊亂。因此，肝腎在生理上相互依存，關(guān)系密切。

4.2 肝與腎在病理上相互影響

肝與腎不僅在生理上關(guān)系密切，通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，其在病理上也相互影響。本實(shí)驗(yàn)以糖尿病腎病大鼠為模型，試圖探討在大鼠腎臟發(fā)生損傷時(shí)的肝損傷情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠肝臟中的TGF-β1，Smad-4和TIMP-1的表達(dá)與正常組相比具有顯著性的升高，MMP-9的表達(dá)則具有顯著性的降低。此結(jié)果說明，從該指標(biāo)的層面上來看，DN大鼠的確存在肝損傷。而在針對(duì)DN大鼠進(jìn)行治療后，肝中TGF-β1與Smad-4的表達(dá)明顯下調(diào)，且TIMP-1和MMP-9也不同程度的降低和升高的趨勢(shì)。這說明在針對(duì)DN大鼠腎臟治療的同時(shí)，肝損傷也得到了一定的修復(fù)，即兩臟“一榮俱榮,一損俱損”，這與中醫(yī)的“肝腎同源”理論相符。中醫(yī)理論認(rèn)為，若腎水虧竭不能涵養(yǎng)肝木；或肝陽過亢，劫耗腎陰；或腎精虧耗，肝血不足，最終都可以導(dǎo)致肝腎雙方陰血的不足，會(huì)因?yàn)椤澳覆〖白印被颉白颖I母氣”而引發(fā)肝腎陰虛，肝陽上亢，腎精虧虛等病理表現(xiàn)?；诖耍P者推斷TGF-β1/Smad通路及TIMP-1/ MMP-9對(duì)ECM代謝調(diào)節(jié)的紊亂可能也是上述中醫(yī)理論在微觀層面的體現(xiàn)之一，同時(shí)，該實(shí)驗(yàn)也說明了肝與腎在病理上的可以相互影響。

4.3 加味消渴康對(duì)DN大鼠肝臟具有保護(hù)作用

本實(shí)驗(yàn)通過選取糖尿病腎病大鼠肝臟內(nèi)TGFβ1，Smad-4，MMP-9和TIMP-1進(jìn)行研究，治療方藥采用了耿建國教授治療糖尿病腎病的驗(yàn)方加味消渴康。該方由黃芪、山茱萸、生薏苡仁、葛根、決明子、丹參、水蛭組成，全方具有健脾益腎，祛瘀化濁的功效[7]。治療12周后，各治療組與模型組相比，TGF-β1，Smad-4和TIMP-1水平均有不同程度降低，MMP-9有一定的升高趨勢(shì)，且TGF-β1，MMP-9，TIMP-1的變化趨勢(shì)與其在腎臟中的水平變化趨勢(shì)一致[8-9]。說明加味消渴康針對(duì)DN大鼠肝中TGFβ1和Smad-4水平升高的結(jié)果，起到了正向調(diào)節(jié)作用，其通過降低肝中TGF-β1和Smad-4的表達(dá)，起到保護(hù)肝損傷的作用。由此可知，加味消渴康在針對(duì)DN大鼠腎臟治療的同時(shí)，肝損傷也得到了一定的修復(fù)，此結(jié)果也為中醫(yī)的“肝腎同源”理論相符提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

5 展望

研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病大鼠中，肝臟也存在損傷，且針對(duì)大鼠的糖尿病腎病進(jìn)行治療后，肝損傷有所減輕，這是“肝腎同源”理論在病理和治療上的具體體現(xiàn)。而中醫(yī)對(duì)糖尿病腎病的治法頗多，因此在下一步的研究中，可以根據(jù)不同的辨證要點(diǎn)，選用不同種類治法的方劑進(jìn)行探討，從而可以更有效的指導(dǎo)臨床實(shí)踐。

“肝腎同源”的內(nèi)容非常廣泛，筆者目前僅在腎損傷的同時(shí)探索肝臟的損傷情況。今后可以通過建立肝損傷的模型來探討腎臟的相關(guān)狀態(tài)，或者根據(jù)“腎主骨，生髓，通于腦”的理論來研究腦的狀態(tài)。通過對(duì)各個(gè)不同的角度的探討，“肝腎同源”理論的實(shí)驗(yàn)依據(jù)將會(huì)日趨完善。

綜上所述，“肝腎同源”不僅有理論推斷，也有實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)證明，兩臟可“同病”，亦可“同治”，而有關(guān)病理切片等形態(tài)學(xué)的觀察及其它指標(biāo)的檢測(cè)則有待于進(jìn)一步探討。

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(本文編輯：董歷華)

TheeffectsofJiaweiXiaokekangontheexpressionsoffactorsregulatingthehepaticextracellularmatrixinDNrats

LIGuang-chao，CHENian-cong，GENGJian-guo，etal.

CollegeoftraditonalChinesemedicine，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China

CHENian-cong，E-mail：cnc088@sohu.com

ObjectiveTo investigate the influence of JiaweiXiaokekang on the expression of TGF-β1, Smad-4, MMP-9 and TIMP-1 in the hepatic tissues of diabetic nephropathy (DN) rats based on the "theory of homogeny of liver and kidney".MethodsThe rat model was established by uninephrectomy and injection of streptozotocin. 50 models were divided into 5 groups: model group，western medicine group and Chinese herb medicine groups including low-dose，medial-dose and high-dose group. There were 10 models in each group. Besides, another 10 normal rats were chosen as the normal group. Western medicine group was given losartan(5.2 mg/kg·d) by intragastric administration；Chinese herb medicine gro ups were given JiaweiXiaokekang(low-dose group:13.125 g/kg·d，medial-dose group:26.25 g/kg·d and high-dose group:52.5 g/kg·d-1) by intragastric administration； The normal group and model group were fed with 2 ml distilled water daily. After 12 weeks, sacrificed all the rats and removed their hepars and then observed the expressions of TGF-β1, Smad-4, MMP-9 and TIMP-1 by immunohistochemistry.ResultsCompared with the normal group，the expression of TGF-β1，Smad-4 and TIMP-1 in other groups significantly increased，while the expression of MMP-9 significantly decreased (P<0.05 orP<0.01). After the treatment，compared with the model group，the expression of TGF-β1 and Smad-4 in other groups significantly decreased. While there was a decreased or increased trend on the expression of TIMP-1 and MMP-9 respectively.ConclusionJiaweiXiaokekang had a certain protective effect on the hepatic injury of DN rats.

Homogeny of liver and kidney； Diabetic nephropathy； Hepatic injury； Transforming growth factor-β1； Matrix metalloproteinase-9； Tissue inhibitor of metalloproteinases-1

首都中醫(yī)藥與護(hù)理研究專項(xiàng)(12ZHY02)

100069 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院[李光超(碩士研究生)、車念聰、耿建國、郭新新、趙暉、白辰(碩士研究生)]；北京市平谷區(qū)中醫(yī)醫(yī)院(王志強(qiáng))

李光超(1986-)，2011級(jí)在讀碩士研究生。研究方向：中醫(yī)肝病的證治規(guī)律研究。E-mail：li252530538@163.com

車念聰(1957-)，本科，教授。研究方向：中醫(yī)肝病的證治規(guī)律研究。E-mail：cnc088@sohu.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.02.003

2013-12-03)