目的:利用快速高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(UFLC-MS/MS)建立血清中氨氯地平的快速定性定量分析方法,為臨床中毒患者的快速診治提供依據(jù)。方法:選用Shim-pack XR-ODS色譜柱,以乙腈10 mmol/L醋酸銨為流動(dòng)相,采用梯度洗脫進(jìn)行分離,流速:0.3 ml/min;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:10μl。樣品用乙腈進(jìn)行蛋白沉淀后進(jìn)樣,選用3200型質(zhì)譜儀的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描方式進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:氨氯地平的線性范圍為0.078~500 ng/ml,定量下限和最低檢測(cè)限分別為0.05 ng/ml和0.005 ng/ml。日內(nèi)精密度為2.5%,日間精密度為3.1%。結(jié)論:本研究所建立的方法快速、靈敏,重復(fù)性好,適用于氨氯地平中毒患者血液標(biāo)本的快速定性定量檢測(cè)。
氨氯地平;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;中毒
[Abstrractbjecttiive:To develop an method for the determination of the amlodipine in human serum by ultra fast liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UFLC-MS/MS)and provide proof for the poisoners′fast diagnosis.Meetthod:Amlodipine was extracted from serum by acetonitrile which was used as deproteinated solvent,and separated on a Shim-pack XR-ODS column maintained at 40℃with acetonitrile and 10 mmol/L ammonium acetate as mobile phase by gradient elution.The flow rate was 0.30 mL/min-and 10μL aliquot of residues were injected.Detection was carried out by multiple reaction monitoring on a 3200 MRM system.Ressullttss:The assay was linear over the range 0.078-500 ng/mL with a limit of quantitation of 0.05ng/mL and a limit of detection of 0.005ng/mL.The relative deviation of intra-and inter-day were 3.1%and 2.5%.Conclussiion:The method was rapid,sensitive and reliable for the determination of amlodipine in human blood serum.The assay was applied to a fast qualitative and quantitative determination of amlodipine poisoners.
氨氯地平(Amlodipine),分子式:C20H25CLN2O5,分子量:408.1,化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下。
氨氯地平是一種1,4-二氫吡啶類(lèi)的長(zhǎng)效降壓藥,其終末消除半衰期約為35~50 h,7~8天后血藥濃度可達(dá)穩(wěn)態(tài)。因其具有服藥劑量低、藥效維持時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn),目前已成為臨床一線用藥。因此,血液中氨氯地平濃度的測(cè)定顯得尤為重要。血清中氨氯地平濃度的測(cè)定主要采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,酶聯(lián)吸附免疫分析法等方法[1-2]。本實(shí)驗(yàn)利用快速高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(UFLC-MS/MS)建立了一種檢測(cè)血清氨氯地平的方法,為臨床急慢性中毒患者的快速診斷和搶救提供了科學(xué)依據(jù)。
1.1 主要儀器與試劑3200型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Applied Biosystem公司產(chǎn)品):配有電噴霧離子化源(ESI)以及Analyst 1.5數(shù)據(jù)處理軟件;UFLC快速高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司產(chǎn)品):包括二元輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、切換閥和柱溫箱;GL-88B振蕩器:江蘇海門(mén)醫(yī)療器械廠。氨氯地平對(duì)照品由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心提供;乙腈、乙酸銨均為色譜純;其他試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)0.22μm水膜濾過(guò)的重蒸水??瞻籽逵山夥跑姷?07醫(yī)院血庫(kù)提供;中毒患者血液標(biāo)本由北京市各醫(yī)院急診科提供,4 ml全血,不加抗凝劑。
1.2 溶液的配制 儲(chǔ)備液的配制:精密稱取1 mg氨氯地平對(duì)照品,置于100 ml容量瓶中,加入乙腈溶解,稀釋至刻度,配制成10μg/ml的儲(chǔ)備液。標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制:取氨氯地平儲(chǔ)備液適量,用65%乙腈稀釋至0.08、0.31、2.50、5.00、10.00、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 ng/ml待用。
1.3 色譜條件 色譜柱:Shim-pack XR-ODS色譜柱(長(zhǎng)度100 mm,直徑3 mm,膜厚0.25μm)。流動(dòng)相:乙腈10 mmol/L醋酸銨梯度洗脫,梯度條件是時(shí)間為0.1、8.0、9.0、16.0 min,乙腈濃度分別為10%、95%、95%、10%。流速:0.30 ml/min;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:10μl。
1.4 質(zhì)譜條件 離子源:離子噴霧離子化源,正離子方式檢測(cè);離子噴射電壓(IS):5500V;溫度:550℃;源內(nèi)氣體(1Gas1)壓力:60psi;氣體(2Gas2)壓力:65 psi;氣簾氣體(CUR)壓力:30 psi;掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);用于定量分析的離子反應(yīng)分別為選擇m/z409.1→m/z238.0(DP電壓:27 eV;CE電壓:16 eV)和m/z409.1→m/z294.0(DP電壓:27 V;CE電壓:14 eV)
1.5 樣品的提取及凈化 取全血4 ml,離心取上層血清用0.1 mol/L NaOH調(diào)至pH=9。取血清0.5 ml加乙腈1 ml,振蕩器混勻1 min。離心分離上清液,0.25μm濾器過(guò)濾至進(jìn)樣瓶待測(cè)。
2.1 優(yōu)化方式 取氨氯地平儲(chǔ)備液,用65%乙腈配制稀釋至1000 ng/L,采用針泵進(jìn)樣模式,進(jìn)行母離子、碎片離子分析,選擇4對(duì)離子反應(yīng)定性,分別為m/z409.1→m/z238.0、m/z409.1→m/z294.0、m/z409.1→m/z377.2、m/z409.1→m/z320.3。優(yōu)化離子源參數(shù)及各對(duì)DP、CE電壓參數(shù),相應(yīng)的母離子掃描圖,見(jiàn)圖1;二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖,見(jiàn)圖2;氨氯地平標(biāo)準(zhǔn)液的保留時(shí)間為8.97 min,見(jiàn)圖3。
2.2 線性范圍 取空白血清,加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制成對(duì)照品血清,血清經(jīng)處理后,進(jìn)樣10 ml進(jìn)行UFLC-MS/MS分析。每個(gè)濃度5個(gè)樣本,連續(xù)測(cè)量3天。以待測(cè)物峰面積(X)對(duì)濃度(Y,ng/ml)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性方程為Y=0.0027X-1.4598,r=0.9999。
圖1 氨氯地平母離子掃描圖
圖2 氨氯地平二級(jí)全掃描質(zhì)量圖
圖3 UFLC-MS/MS測(cè)定人全血中氨氯地平的典型色譜圖
2.3 檢出限 選擇m/z409.1→m/z238.0(DP電壓:27eV;CE電壓:16eV)和m/z409.1→m/z294.0(DP電壓:27 V;CE電壓:14 eV)為定量分析的離子反應(yīng),信噪比(S/N)取30:1,標(biāo)準(zhǔn)液最低檢出限可達(dá)到0.005 ng/ml。
2.4 回收率及精密度測(cè)定 取0.1、10.0、500.0 ng/ml對(duì)照品血清,用乙腈提取。每濃度5樣本,連續(xù)測(cè)定3天。根據(jù)當(dāng)日的工作曲線,計(jì)算樣品的測(cè)得濃度,進(jìn)行回收率及精密度測(cè)定分析。三個(gè)濃度的平均回收率依次為109.7%、100.8%、99.6%。日內(nèi)精密度為2.5%,日間精密度為3.1%。
在實(shí)踐工作中,氨氯地平中毒患者主要以自殺為目的主動(dòng)服用者居多;其次是長(zhǎng)期服用或未嚴(yán)格依照醫(yī)囑服用而造成的氨氯地平蓄積性中毒。氨氯地平中毒患者輕者多伴有頭暈、惡心、嘔吐等胃腸道癥狀,嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致昏迷。因此,還要與胃腸道疾病和腦病進(jìn)行鑒別診斷。本方法采用的梯度洗脫條件,在保證靈敏度的前提下,能檢出大多數(shù)臨床常見(jiàn)藥品毒物,為臨床快速救治提供參考。據(jù)本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)記錄統(tǒng)計(jì),2008年至2012年間,氨氯地平中毒檢測(cè)出46例。臨床上,氨氯地平的治療量應(yīng)小于2 ng/ml。兒童的中毒劑量應(yīng)該更低。氨氯地平因其分子量大,血液透析不易清除,一般采用血液灌流或血液置換[3]。
氨氯地平血液含量很低,以往的檢測(cè)方法多采用高效液相色譜法,并不能滿足臨床需求。因氨氯地平見(jiàn)光易分解,整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)盡量避光[4]。本實(shí)驗(yàn)采用UFLC-MS/MS方法快速定量血清含量,選用MRM模式定量氨氯地平藥物濃度,選用較有特異性且豐度相對(duì)較高的4對(duì)反應(yīng)離子,減少了非目標(biāo)化合物的干擾,具有選擇性好,靈敏度高,分析時(shí)間短,重復(fù)性好等特點(diǎn)。應(yīng)用此方法也可檢測(cè)尿液中氨氯地平的濃度,有利于臨床觀察不同治療方法的效果。
利用所建方法檢測(cè)了15例疑似氨氯地平急、慢性中毒患者的血清標(biāo)本。結(jié)果10例中毒患者血清中檢測(cè)到氨氯地平,濃度范圍為0.5~280 ng/ml。病例1:女,76歲。不明原因昏迷入院,初期血壓降低不明顯,6 h急送篩查鎮(zhèn)靜安眠類(lèi)藥物及降血壓類(lèi)藥物,血清氨氯地平濃度為280.0 ng/ml,30 h后復(fù)測(cè)降至165 ng/ml,血液灌流治療后54 h降至74 ng/ml, 7天后血清中檢測(cè)不到氨氯地平?;颊哐鍣z測(cè)全掃描圖,見(jiàn)圖4,與氨氯地平標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間一致。病例2:男,51歲,長(zhǎng)期服用氨氯地平6個(gè)月后送檢血液,利用本方法檢測(cè)血清氨氯地平濃度為6.9 ng/ml。病例3:女,2歲,誤服氨氯地平4 mg,3 h送檢,血清氨氯地平濃度為1.8 ng/ml。
圖4 氨氯地平中毒患者血清全掃描色譜圖
本方法針對(duì)中毒患者血清標(biāo)本,采用乙腈提取,操作簡(jiǎn)單。利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè),建立了一種快速檢測(cè)氨氯地平的方法,為氨氯地平急慢性中毒患者的快速診斷和搶救提供了科學(xué)依據(jù)。
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(收稿:2014-03-03修回:2014-03-14編校:齊 彤)
UFLC-MS/MS法測(cè)定中毒患者血清中氨氯地平的濃度
李嘉琳,邱澤武,孫愛(ài)麗,孫成文
UFLC-MS/MS determination of amlodipine in poisoned human blood serum
LI Jia-lin,QIU Ze-wu,SUN Ai-li,SUN Cheng-wen.Poisoning treatment center,PLA 307 Hospital,Beijing 100071,China
Corresponding author:SUN Cheng-wen,E-mail:suncw163@163.com
amlodipine;UFLC-MS/MS;poison
R 994.3;O 657.7
A
2095-3496(2014)02-0087-03
100071北京,解放軍第307醫(yī)院全軍中毒救治中心(李嘉琳,邱澤武,孫愛(ài)麗,孫成文)
孫成文,E-mail:suncw163@163.com
災(zāi)害醫(yī)學(xué)與救援(電子版)2014年2期