何詩依，陳 婷，孫海洋，張 纓

不同低氧暴露時間對小鼠骨骼肌ERRα/PDK4調(diào)節(jié)的影響

何詩依1，陳 婷2，孫海洋1，張 纓1

目的：研究不同低氧暴露時間對小鼠骨骼肌雌激素受體相關(guān)受體(estrogen receptor related receptors α，ERRα)與丙酮酸脫氫酶激酶4(PDK4)DNA結(jié)合活性及PDK4基因表達(dá)的影響，以探討低氧條件下影響糖代謝及其信號分子之間的相互調(diào)節(jié)可能的機(jī)制。方法：野生小鼠隨機(jī)分為常氧組、低氧組(氧濃度11.25%左右，模擬海拔高度4 500 m)，而后又進(jìn)一步分為0天、7天、14天、28天組，每組10只。低氧暴露時間為每天8 h。同天數(shù)的小鼠常氧組與低氧組脫頸處死。染色質(zhì)免疫共沉淀法(Chip)測定ERRα/PDK4結(jié)合活性，Real-Time PCR測定骨骼肌PDK4 mRNA含量。結(jié)果：1)隨著天數(shù)增加，低氧組ERRα/PDK4的結(jié)合活性有增加的趨勢，但沒有顯著性差異；2)隨著天數(shù)增加，低氧28天組PDK4 mRNA相對表達(dá)量與0天組相比顯著性升高(P<0.05)，且與28天常氧組相比也有顯著性增加(P<0.05)。結(jié)論：低氧28天小鼠骨骼肌PDK4 mRNA相對表達(dá)量顯著增加，但其ERRα/PDK4的結(jié)合活性并沒有顯著性變化，推測低氧下ERRα并不是促進(jìn)PDK4 mRNA表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子。

雌激素受體相關(guān)受體；丙酮酸脫氫酶激酶4；低氧

低氧暴露是低氧訓(xùn)練的一個重要組成成分，骨骼肌的糖代謝與低氧適應(yīng)關(guān)系密切[1]。然而，低氧是如何影響糖代謝及其信號分子之間的相互調(diào)節(jié)機(jī)制，目前并不十分清楚。

有研究報(bào)道，在低氧下可激活低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)，進(jìn)而通過提高糖酵解酶的活性來提高ATP的產(chǎn)量[6]。骨骼肌葡萄糖代謝中丙酮酸脫氫酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase isoform 1，PDK1)是HIF-1α轉(zhuǎn)錄的靶基因[4]，PDK1能夠抑制葡萄糖有氧氧化的關(guān)鍵限速酶——丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDC)催化丙酮酸生成乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)有氧氧化[4]。因此，低氧下HIF-1α除了直接增強(qiáng)糖酵解代謝酶活性外，還通過PDK1間接抑制葡萄糖有氧氧化的關(guān)鍵酶PDC的活性，從而促進(jìn)低氧下葡萄糖的糖酵解供能，進(jìn)行糖代謝的低氧適應(yīng)。

近年來發(fā)現(xiàn)， ERRα對能量代謝有調(diào)節(jié)作用[3]。有研究表明，HIF-ERR兩種蛋白能夠相互作用，在缺氧的代謝適應(yīng)中HIF可能與能量代謝重要調(diào)節(jié)器ERRs有關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，PDK4是ERRα轉(zhuǎn)錄因子的靶基因[11]。作為PDK1同工酶的PDK4，在糖代謝中有著與PDK1同樣的作用。因此推測，在低氧刺激下除HIF-1α/PDK1通路抑制葡萄糖的有氧代謝外，可能還存在著 HIF-1α-ERRα/PDK4這樣一條分子信號傳導(dǎo)通路，共同調(diào)節(jié)骨骼肌糖代謝的有氧/無氧進(jìn)程，以達(dá)到低氧適應(yīng)目的。

本實(shí)驗(yàn)試圖通過不同低氧暴露時間，探討ERRα對PDK4轉(zhuǎn)錄活性以及PDK4 mRNA的影響，從而確定ERRα/PDK4調(diào)控在小鼠骨骼肌糖代謝低氧適應(yīng)中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象與方案

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及飼養(yǎng)方式

健康5～6周齡C57BL/6J野生(Wild-type，WT)小鼠，體重18±2 g，在北京體育大學(xué)動物飼養(yǎng)房中分籠正常飼養(yǎng)，每籠3～4只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)分組

將C57BL/6J野生小鼠隨機(jī)分為常氧組和低氧組，而后又進(jìn)一步分為0天、7天、14天、28天組，每組10只。常氧組小鼠在常氧下正常籠中生活，低氧組小鼠在常壓低氧環(huán)境下正?；\中生活，每天8 h低氧暴露于北京體育大學(xué)低氧房中(模擬海拔高度4 500 m，氧濃度11.25%左右)。

1.1.3 取材

同天數(shù)的小鼠常氧組與低氧組脫頸處死，立即取兩側(cè)小腿骨骼肌后迅速稱量，并在-80℃低溫冰箱保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的測定

1.2.1 PDK4 mRNA表達(dá)的測定

1.總RNA的提?。喝⌒∈蠊趋兰?0 mg，加入0.8 ml Trizol試劑(Invitrogen)先后經(jīng)過分相、分離RNA、洗滌RNA和再懸浮RNA；

2.逆轉(zhuǎn)錄cDNA：利用PCR擴(kuò)增儀(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司，MG96+/Y)和RT-PCR試劑盒(Toyobo，F(xiàn)SQ101)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，之后在-20℃凍存。

3.實(shí)時熒光相對定量PCR：采用美國ABI 7500熒光定量PCR儀和Toyobo公司生產(chǎn)的熒光染料反應(yīng)體系(SYBR Green Realtime PCR Master Mix)，以及PDK4引物 (QIAGEN，QT00157248)和18rRNA引物(QIAGEN，QT00157248)。反應(yīng)體系包括：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μl，引物2 μl，CDNA模版2 μl，ddH2O 6 μl。目的基因表達(dá)結(jié)果用比較CT法相對定量，目的基因=2-△△CT。

1.2.2 ERRα/PDK4 DNA結(jié)合活性測定

ERRα和PDK4活性采用染色質(zhì)免疫沉淀法(CHIP)，具體步驟：

1.提取核蛋白并測定濃度，調(diào)整總蛋白一致，分為IP樣品管和Input的對照管；用IP buffer補(bǔ)足IP管體積至1.5 ml；加入10 μl ERRα抗體，4℃過夜。

2.加入40 μl Protein A/G plus-agarose,2 μl 鯡魚精DNA，4℃ 1.5 h搖床；沉淀抗體識別的蛋白或相應(yīng)的復(fù)合物， 2 500 rpm 1 min，棄上清液,沉淀用IP buffer 洗滌3 次,IP washing buffer 4次洗滌，150 μl elution buffer 震蕩10 min,4℃ 14 000 rpm 3 min，取上清液( 含抗體/蛋白/ DNA 復(fù)合物)，重復(fù)1 次，合并上清液(共300 μl)；300 μl上清液中加入18 μl 5M NaCl， 65℃加熱4.5 h，去除蛋白和基因組DNA之間的交聯(lián)；用IP elution buffer補(bǔ)足Input對照至300 μl，同樣加入18 μl 5M NaCl， 65℃加熱4.5 h，去除蛋白和基因組DNA之間的交聯(lián)；800 μl無水乙醇，-20℃沉淀過夜。

3.4℃ 14 000 rpm 20 min，棄上清液，1 ml 70% 乙醇洗滌沉淀，4℃ 14 000 rpm 10 min，棄上清，風(fēng)干10 min；100 μl TE buffer，加入11 μl Proteinase K buffer，1 μl蛋白酶K，55℃孵育1 h；加入290 μl TE 混勻后，加入400 μl 苯酚-氯仿-異戊醇，震蕩1 min，14 000 rpm 1 min；取上清液,并加入40 μl 3M NaAC，0.25 μl肌糖元，750 μl無水乙醇，-20℃沉淀過夜。

4.4℃ 14 000 rpm 20 min，棄上清液，1 ml 70%乙醇洗滌沉淀，4℃ 14 000 rpm 10 min，棄上清液，風(fēng)干沉淀，加16 μl去核酶水沉淀，用于PCR檢測。

5.實(shí)時熒光相對定量PCR：采用美國ABI 7500熒光定量PCR儀和Toyobo公司生產(chǎn)的熒光染料反應(yīng)體系(SYBR Green Realtime PCR Master Mix)和PDK4引物。

根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物(此引物由上海生物工程有限公司合成)以擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子ERRα與PDK4啟動子結(jié)合位點(diǎn)(TCAATGTCA)的片段(表1)[10]。

PCR分別擴(kuò)增IP樣本、IgG對照樣本和Input樣本，并用1%瓊脂糖凝膠分別檢驗(yàn)擴(kuò)增效果。目的基因表達(dá)結(jié)果用比較CT法相對定量，目的基因=2-△△CT。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同低氧暴露時間對小鼠骨骼肌ERRα /PDK4 DNA結(jié)合活性的影響

同天數(shù)的低氧組與常氧組相比，ERRα/PDK4 DNA的結(jié)合活性有增加的趨勢，但無顯著性差異(圖1、圖2)。

圖 1 本研究ERRα/PDK4 DNA 結(jié)合活性PCR擴(kuò)增效果圖

圖 2 本研究不同時間低氧對小鼠骨骼肌ERRα/PDK4 DNA結(jié)合活性影響示意圖

2.2 不同低氧時間對小鼠骨骼肌PDK4 mRNA表達(dá)的影響

與0天組相比，低氧28天組小鼠PDK4 mRNA相對表達(dá)量有顯著性的升高(P<0.05)；28天低氧組與其常氧組相比，PDK4 mRNA的相對表達(dá)量顯著性升高(P<0.05，圖3)。

3 分析與討論

低氧條件可刺激機(jī)體產(chǎn)生HIF-1α，HIF-1α作為轉(zhuǎn)錄因子能誘導(dǎo)其一系列靶基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)靶基因mRNA水平增加，進(jìn)而進(jìn)一步參與機(jī)體進(jìn)行低氧適應(yīng)[9]。

圖 3 本研究不同低氧暴露時間對小鼠骨骼肌PDK4 mRNA相對表達(dá)量圖

PDK1作為HIF的靶基因，可磷酸化催化糖代謝中間產(chǎn)物丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A的關(guān)鍵酶——PDC，使之失去活性，抑制糖的有氧氧化途徑[4]。在低氧條件下，HIF-1通過提高PDK1的活性，降低有氧氧化進(jìn)程，從而促使糖酵解反應(yīng)速率的加快[7]。研究發(fā)現(xiàn)，低氧條件下人類腎臟癌細(xì)胞系中的HIF-1α能夠和PDK1基因的啟動子直接結(jié)合，促進(jìn)PDK1 DNA的轉(zhuǎn)錄。敲除HIF-1α之后，低氧下PDK1的轉(zhuǎn)錄水平相對于常氧下無變化[12]。PDK4作為PDK1的同工酶，對于PDC有著同樣的抑制作用。在Zhong L等人[12]的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在SIRT6缺陷小鼠(SIRT6可以作為HIF-1α輔阻遏物)HIF-1α活性升高，使得PDK1和PDK4的表達(dá)量均升高，這一現(xiàn)象間接地表明HIF-1α也能夠調(diào)節(jié)PDK4。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，隨著低氧暴露時間的延長，28天的間接性低氧暴露可促進(jìn)小鼠骨骼肌中PDK4的mRNA表達(dá)。因而，低氧下PDK4表達(dá)的增加可抑制PDC活性，節(jié)省氧，從而降低糖的有氧氧化，并進(jìn)一步提高糖酵解途徑，使機(jī)體骨骼肌糖代謝達(dá)到低氧適應(yīng)。

雌激素相關(guān)受體(ERRs)作為對能量代謝調(diào)節(jié)有著十分重要作用的轉(zhuǎn)錄因子[8]，有ERRα、ERRβ和ERRγ 3種亞型。有研究發(fā)現(xiàn)，HIF-ERR兩種蛋白能夠相互作用，而且ERRs能夠促進(jìn)HIF的轉(zhuǎn)錄[2]。同時，在Lee J H[5]的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，低氧下ERRγ的轉(zhuǎn)錄活性升高，且采用干擾RNA降低HIF-1α的表達(dá)后，低氧下ERRγ轉(zhuǎn)錄活性受到抑制。接著他們在ERRγ的啟動子上找到了與HIF-1α結(jié)合的兩個位點(diǎn)，并觀察到如果ERRγ的這兩個結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變，低氧下HIF-1α將不能作用于ERRγ。最后，他們又通過CHIP實(shí)驗(yàn)表明，低氧下HIF-1α對ERRγ轉(zhuǎn)錄活性有調(diào)節(jié)作用。Lee J H的以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，低氧下HIF-1α可直接調(diào)節(jié)ERRγ DNA 的轉(zhuǎn)錄。

此外，Lee J H[5]的實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，ERRγ的過表達(dá)會提高PDK4的表達(dá)；低氧下ERRγ與PDK4 DNA的結(jié)合活性顯著性增加。如果低氧下HepG2細(xì)胞中降低ERRγ表達(dá)，并沒有完全抑制對PDK4 DNA的轉(zhuǎn)錄，提示，可能存在ERRα轉(zhuǎn)錄活性的代償作用[5]。ERRs的3種亞型具有高度序列一致性，能夠調(diào)控同一種目的基因[3]。文獻(xiàn)已報(bào)道，PDK4是ERRs轉(zhuǎn)錄因子的靶基因[11]。在小鼠的肝臟癌細(xì)胞中，ERRα和ERRγ能夠促進(jìn)PDK4的表達(dá)，并且在PDK4啟動子375/-330區(qū)域有ERRs的結(jié)合位點(diǎn)[11]。

關(guān)于低氧下ERRα是否調(diào)節(jié)PDK4的轉(zhuǎn)錄活性的在體實(shí)驗(yàn)，至今國內(nèi)、外報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過對小鼠不同時間低氧暴露，采用CHIP方法觀察野生鼠骨骼肌ERRα/PDK4 DNA轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)現(xiàn)隨著低氧暴露時間的延長，小鼠骨骼肌的ERRα/PDK4 DNA結(jié)合活性有增加的趨勢，但沒有顯著性差異。同時，對小鼠骨骼肌PDK4 mRNA的RT-PCR分析表明，低氧28天骨骼肌PDK4的mRNA活性顯著性增加。說明不同時間的低氧暴露，ERRα不是骨骼肌PDK4轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)節(jié)者。推測低氧下ERRγ可能對骨骼肌PDK4基因轉(zhuǎn)錄有著重要的調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié)論

低氧28天小鼠骨骼肌PDK4 mRNA相對表達(dá)量顯著增加，但其ERRα / PDK4的結(jié)合活性并沒有顯著性變化，推測低氧下ERRα并不是促進(jìn)PDK4 mRNA表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子。

[1]周燚,李良鳴,方彩華.低氧適應(yīng)對糖代謝的影響及機(jī)制[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2008,(12):4745-4728.

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EffectsofHypoxiawithDifferentTimeonRegulationsofERRαBindingtothePDK4PromoterinSkeletalMuscleofMice

HE Shi-yi1,CHEN Ting2,SUN Hai-yang1,ZHANG Ying1

Objective:Different time hypoxic exposure inducing ERRα binding to the PDK4 promoter and PDK4 mRNA expression was investigated,which is to discuss the possible mechanism of carbohydrate metabolism and regulations among signal molecules under hypoxic conditions.Methods:Wild-type C57BL/6J mice were subjected to either normoxia or hypoxia.Mice in the hypoxia groups were exposed to a hypobaric chamber that replicated the hypobaric hypoxia conditions found at 4 500m altitude for 8 hours a day.And then each group with 10 mice is also randomly based on the different days(0,7,14,28).Mice of the normoxic and hypoxic groups in the same days were sacrificed.Performing CHIP assay to confirm the hypoxia treated regulation of ERRα on PDK4 promoter.PDK4 mRNA was measured by Real Time-PCR.Results:1) When hypoxia exposed for 14 days and 28 days,ERRα recruitment on PDK4 promoter trends to elevate but has no significance;2) Comparing with 0 day groups and normoxia 28 days group,hypoxia 28 days group’s PDK4 mRNA was significantly increased (P<0.05).Conclusion:Under 28 days’ exposure of hypoxia,PDK4 mRNA was significantly increased in mice skeletal;muscles,but the ERRα recruitment on PDK4 promoter has no significant augment.So,we conjecture ERRα as a compensatory transcription control mechanism to PDK4.

ERRα;PDK4;hypoxia

1000-677X(2014)02-0075-04

2013-05-06；

：2013-10-25

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31171140)；全國大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目。

何詩依(1992-)，女，湖南益陽人，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動生物化學(xué)， E-mail：hsyiyi@126.com；張纓(1961-)，女，北京人，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動和骨骼肌代謝，Tel：(010)62989584，E-mail：zhyi9256@126.com。

1.北京體育大學(xué) 運(yùn)動人體科學(xué)學(xué)院，北京 100084；2.楊百翰大學(xué) 生理和發(fā)展生物學(xué)，美國猶他州，普羅佛84602 1.Beijing Sport University,Beijing 100084,China;2.Brigham Young University,Provo 84602,USA.

G804.7

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