孫囡囡，劉 嘉，鄭燦輝，周有駿 (第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室，上海 200433)

癌癥是嚴(yán)重威脅人類健康的多發(fā)病，據(jù)第3次全國居民死亡原因抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，惡性腫瘤是城市居民的首位死因，占城市死亡總數(shù)的25.0%，農(nóng)村居民的第二位死因[1]?；瘜W(xué)藥物治療是我們對抗癌癥的有力武器，研發(fā)抗腫瘤藥物刻不容緩。

微管蛋白是抗腫瘤研究的重要靶點(diǎn)[2，3]，一直是抗腫瘤藥物的重要研究領(lǐng)域。已有多個作用于微管蛋白的藥物(如紫杉醇、長春新堿等)用于臨床治療。研究發(fā)現(xiàn)微管蛋白的藥物作用部位主要有紫杉醇、長春新堿及秋水仙堿等位點(diǎn)。其中秋水仙堿位點(diǎn)較優(yōu)，因?yàn)槠浠钚郧惠^小，更適合設(shè)計(jì)小分子藥物，因而近年來受到廣泛重視，成為目前的研究熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。

本課題組劉嘉等在前期研究中設(shè)計(jì)合成了一類全新骨架的微管抑制劑：新型四氫萘酮類化合物。其中化合物22b(圖1)的微管蛋白和人白血病腫瘤細(xì)胞(CEM)的抑制活性分別達(dá)3.93 μmol/L、1 nmol/L，對移植人體腫瘤腸癌HT-29的裸鼠腫瘤抑制活性達(dá)66%。最大耐受劑量為300 mg/kg，結(jié)果顯示化合物22b抗腫瘤活性強(qiáng)、毒性低[4]，具有深入研究的價(jià)值。

但研究發(fā)現(xiàn)此類化合物不穩(wěn)定，隨著放置時間延長其活性逐漸下降。結(jié)構(gòu)分析認(rèn)為，化合物22b結(jié)構(gòu)中四氫萘環(huán)1位雙鍵與2位羰基形成了α，β-不飽和酮共軛結(jié)構(gòu)。該結(jié)果易形成激發(fā)態(tài)，由激發(fā)態(tài)到基態(tài)的躍遷有可能引起了雙鍵的構(gòu)型翻轉(zhuǎn)，這可能是該化合物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定及活性下降的原因。因此，將結(jié)構(gòu)中羰基還原成醇，破壞α，β-不飽和酮共軛結(jié)構(gòu)，將有助于提高化合物穩(wěn)定性而提高活性。因而設(shè)計(jì)合成了(E)-6-甲氧基-1-(3，4，5-三甲氧基苯亞甲基)-1，2，3，4-四氫-2-萘醇的消旋體及其對映異構(gòu)體。采用1H NMR、13C NMR、MS確定其結(jié)構(gòu)，采用X-單晶衍射確定其立體構(gòu)型，并考察不同對映異構(gòu)體對微管蛋白、HCT-116和CCRF-CEM 腫瘤細(xì)胞的抑制活性。目標(biāo)化合物的合成路線見圖2：

以2，6-二甲氧基萘為起始原料，經(jīng)還原、Knoevenael縮合制得中間體萘酮，再以CBS不對稱催化還原分別制得R-、S-構(gòu)型的目標(biāo)化合物[5]。

圖1 22b的結(jié)構(gòu)

圖2 目標(biāo)化合物合成路線

1 化學(xué)部分

1.1 儀器和材料 Bruker SMART APEX DUO型雙光源微焦斑結(jié)構(gòu)分析儀，85-1型磁力攪拌器；KE-20-5型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵；RK-Z 型熔點(diǎn)儀，溫度未校正。質(zhì)譜以Hewlett．Packard 5988型質(zhì)譜儀測定，EI源，70 eV直接進(jìn)樣；核磁共振氫譜用Bruker AC-300P型儀器測定。所有試劑皆為市售分析純。

1.2 試劑干燥 無水甲苯:甲苯中加入CaH2(5 g/L)，回流5 h，蒸餾后分子篩(4?)保存。

1.3 目標(biāo)化合物的合成與結(jié)果

1.3.1 6-甲氧基-3， 4-二氫-2-萘酮(1)的合成 按參考文獻(xiàn)[6]制備，收率75%，mp 38～40℃。

1.3.2 (E)-6-甲氧基-1-(3，4，5-三甲氧基苯亞甲基)-3，4-二氫-2-萘酮(22b)的合成 按參考文獻(xiàn)[7]制備，產(chǎn)率47%。mp 102℃～103℃。

1.3.3 (E)-6-甲氧基-1-(3，4，5-三甲氧基苯亞甲基)-1，2，3，4-四氫-2-萘酚(A)的合成 化合物22b (2 g，5.65 mmol)溶于30 ml 10%的二氯甲烷甲醇溶液中，加入硼氫化鈉 (5 mg，0.13 mmol)，室溫?cái)嚢?0 min，濃縮反應(yīng)液，加入水50 ml，乙酸乙酯50 ml，萃取。乙酸乙酯層用水、飽和NaCl溶液洗，無水NaSO4干燥。蒸干乙酸乙酯。重結(jié)晶[石油醚-乙酸乙酯(1:5)]，得白色針晶1.7 g，收率85%。mp 128℃。

1H NMR(300 MHz，CDCl3) δ 7.60 (d，J=9 Hz，1H)，7.00 (s，1H)，6.77～6.81 (m，3H)，6.68 (d，J=2.7 Hz，1H)，5.05 (t，J= 2.44 Hz，1H)，3.93 (m，10H)，3.82 (s，3H)，3.10～3.22 (m，1H)，2.68～2.76 (m，1H)，2.01～2.15 (m，1H)，1.95～2.09 (m，1H)。

13C NMR(300 MHz，CDCl3) δ 201.78，159.42，152.91，140.23，138.68，133.21，132.59，130.60，130.46，124.86，112.73，111.81，106.86，60.89，55.93，55.25，36.98，28.05。

HRMS (ES+)m/z：379.1518(M+Na+)。

1.4 結(jié)果與討論 合成了(E)-6-甲氧基-1-(3，4，5-三甲氧基苯亞甲基)-1，2，3，4-四氫-2-萘醇的消旋體及其對映異構(gòu)體，并經(jīng)1H NMR、13C NMR、MS確證結(jié)構(gòu)。所合成的目標(biāo)化合物均未見文獻(xiàn)報(bào)道。

對不對稱還原的反應(yīng)條件進(jìn)行了探索。結(jié)果表明在硼烷二甲硫醚絡(luò)合物、CBS催化劑、化合物22b的投料比例為5:1:5，溶劑為無水甲苯，溫度為-20℃時為最佳反應(yīng)條件。同時溶劑干燥與否，以及滴加化合物22b的速度直接影響產(chǎn)率；滴加化合物22b的速度過快將導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物的光學(xué)純度降低。因此滴加速度應(yīng)控制在0.1 ml/min。CBS催化劑的投料比例降低、溫度升高都不利于得到高光學(xué)純度的產(chǎn)物。

1.5 化合物C晶體結(jié)構(gòu)測定及結(jié)果 將C(0.230 mm×0.090 mm×0.080 mm)單晶置于結(jié)構(gòu)分析儀上，采用石墨單色化的CuKα射線(λ=1.541 78 ?)，以φ-ω掃描方式在173(2)收集衍射數(shù)據(jù)。在2.583°≤θ≤67.972 °(h:-4～5，k: -11～12，l：-41～37)收集9 057個強(qiáng)反射數(shù)據(jù)。其中獨(dú)立衍射點(diǎn)3 167個[Rint=0.052 2]。強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行了經(jīng)驗(yàn)吸收校正和LP校正?；衔顲的晶體結(jié)構(gòu)解析采用直接法，結(jié)構(gòu)解析和計(jì)算使用SHELXS-97和SHELXL-97程序。

分子結(jié)構(gòu)解析表明，C的組成為C21H24O5，相對分子質(zhì)量為356.40，屬斜方晶體，P2 (1)/c空間群，晶體參數(shù)a=4.965 3(1) ?，b=10.622 8(2) ?，c=34.212 9(6) ?，α=β=γ= 90°，V=1 804.57(6) ?，Z=4，Dc=1.312 mg/m3，μ=0.759 mm-1，F(xiàn)(000)=760，最終偏振因子0.044 6，wR2 = 0.116 7。

化合物C的分子結(jié)構(gòu)見圖3，主要晶體學(xué)數(shù)據(jù)見表1。晶體學(xué)數(shù)據(jù)表明根據(jù)CBS反應(yīng)機(jī)制所合成的光學(xué)異構(gòu)體立體結(jié)構(gòu)正確。

圖3 化合物C的分子結(jié)構(gòu)圖

2 生物活性測試

2.1 抑制微管聚合活性實(shí)驗(yàn)

2.1.1 材料與方法 材料：牛微管蛋白(生產(chǎn)廠家：Cytoskeleton)。緩沖液General Tubulin Buffer: 80 mmol/L PIPES pH=6.9，2 mmol/L MgCl2，0.5mmol/L EGTA。Tubulin Glycerol Buffer: 60% glycerol。GTP：100 mmol/L。96孔半面積培養(yǎng)板。儀器：Synergy 4型全自動酶標(biāo)儀。方法：采用文獻(xiàn)[8]及微管蛋白試劑盒方法。通過測定每分鐘340 nm處的OD值繪制消光度曲線，由公式計(jì)算IC50。

表1 化合物C的主要晶體學(xué)數(shù)據(jù)

微管蛋白聚合抑制率(%)=

2.1.2 抑制微管聚合結(jié)果,見表2。

表2 化合物A、B、C的微管蛋白抑制活性

2.2 體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 材料與方法 采用MTT法，對所有目標(biāo)化合物進(jìn)行人白血病細(xì)胞(CCRF-CEM)、人腸癌細(xì)胞(HCT-116)瘤株進(jìn)行體外抗腫瘤活性增值實(shí)驗(yàn)，并以化合物22b為陽性對照。通過測定570 nm處測定OD值，用Bliss法計(jì)算IC50值[4]。

2.2.2 抑制腫瘤增殖結(jié)果，見表3。

2.3 結(jié)果與討論 微管蛋白抑制活性結(jié)果顯示，目標(biāo)化合物消旋體(A)和S-構(gòu)型異構(gòu)體(B)的微管蛋白抑制活性優(yōu)于先導(dǎo)化合物22b，其中S-構(gòu)型異構(gòu)體(B)的抑制活性最強(qiáng)，其IC50值達(dá)0.41 μmol/L，為化合物22b的9.6倍。體外抑瘤活性結(jié)果顯示，S-構(gòu)型異構(gòu)體(B)對人腸癌細(xì)胞(HCT-116)的抑瘤最強(qiáng)，IC50值為0.14 μmol/L，分別為消旋體(A)的1.5倍和22b的3.4倍。S-構(gòu)型異構(gòu)體(B)對人白血病細(xì)胞(CCRF-CEM)的抑制活性與消旋體(A)和化合物22b相當(dāng)，大大優(yōu)于其R-構(gòu)型異構(gòu)體(C)。其對CCRF-CEM的抑制活性是R-構(gòu)型異構(gòu)體(C)的3 940倍。生物活性評價(jià)結(jié)果表明，S-構(gòu)型異構(gòu)體(B)對微管蛋白及兩種測試腫瘤細(xì)胞均有很強(qiáng)的抑制活性，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

表3 化合物A、B、C的體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性IC50(μmol/L)

本設(shè)計(jì)合成了一類新骨架的具有抗腫瘤活性的小分子微管蛋白抑制劑。研究提出了制備高收率及高光學(xué)純度目標(biāo)化合物的不對稱合成方法，為該類化合物的不對稱合成提供了新的研究途徑。研究發(fā)現(xiàn)了高活性的S-構(gòu)型目標(biāo)化合物，為深入開展抗腫瘤藥物研究提供了候選化合物。

【參考文獻(xiàn)】

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