王 獻(xiàn)，王 朗

(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 武漢 430074)

近年電噴霧質(zhì)譜廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)非共價復(fù)合物的研究[1-3]，其顯著特點是蛋白質(zhì)等生物大分子產(chǎn)生多電荷離子，使質(zhì)荷比降至質(zhì)譜儀的檢測范圍，使生物大分子的分析檢測成為可能；另一方面電離過程是在大氣壓條件下的離子化室進(jìn)行，離子化效率高，靈敏度高.電噴霧電離是一種軟電離技術(shù)，可在離子化的過程中保持分子間較弱的非共價鍵作用，并直接提供蛋白質(zhì)復(fù)合物重要的化學(xué)計量學(xué)信息，故電噴霧質(zhì)譜是研究蛋白質(zhì)多聚體和蛋白質(zhì)復(fù)合物的有力工具[4-7].

甲狀腺素運載蛋白(TTR)是一種同源四聚體蛋白，在生物體內(nèi)主要由肝臟合成，分子量大約為55 Ku，在血液中主要運載甲狀腺素(T4)，每個四聚體含有兩個甲狀腺素結(jié)合位點[8-10].四溴雙酚A(TBBPA)是一種常用的溴代阻燃劑，廣泛應(yīng)用于各種家用、工業(yè)用品中.近年來，多種環(huán)境介質(zhì)中均檢測到四溴雙酚A，且濃度逐年增加，四溴雙酚A的環(huán)境毒理研究越來越受到研究者的關(guān)注[11-13].目前，關(guān)于四溴雙酚A(TBBPA)的內(nèi)分泌干擾毒理的研究報道較少[14,15]，有兩種可能的毒理機(jī)制：一是四溴雙酚A抑制三碘甲狀腺原氨酸(T3，由T4脫碘生成)和甲狀腺素受體的結(jié)合，干擾了生物體內(nèi)甲狀腺素的含量和生理效應(yīng)；另一種可能是TBBPA在生物體內(nèi)競爭性的結(jié)合到甲狀腺素運載蛋白上，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，干擾了甲狀腺素的運輸和正常的生理功能.本文通過電噴霧質(zhì)譜法研究了四溴雙酚A與甲狀腺素運載蛋白的相互作用，檢測出四溴雙酚A可與甲狀腺素運載蛋白四聚體形成穩(wěn)定的摩爾比為1︰1、2︰1的蛋白質(zhì)復(fù)合物，為上述第二種毒理機(jī)制提供了實驗依據(jù)，有助于進(jìn)一步的四溴雙酚A毒理研究.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(Agilent 1200, 美國安捷倫科技有限公司)，電噴霧四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(Agilent 6520 ESI Q-TOF MS, 美國安捷倫科技有限公司)，高速冷凍離心機(jī)(GL-20M, 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，超純水機(jī)(Molelement 1815a摩爾元素型, 上海摩勒科學(xué)儀器有限公司)，數(shù)控超聲波清洗器(KQ-25DB, 昆山市超聲儀器有限公司).高精度數(shù)控?fù)u床(SHZ-03,上?？蚌蝺x器設(shè)備有限公司).

甲狀腺素運載蛋白(來源于人類血漿, Sigma公司)，四溴雙酚A(分析標(biāo)準(zhǔn)品, Aladdin公司)，二甲亞砜(DMSO)、冰醋酸(分析純, 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).

1.2 儀器條件

參考文獻(xiàn)[16],1200液相系統(tǒng)自動進(jìn)樣器直接進(jìn)樣，流動相為超純水(含體積比0.5‰的冰醋酸)，流速0.1 mL/min，進(jìn)樣體積1 μL.電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，一定的干燥氣溫度和裂解電壓，干燥氣流速11 L/min，霧化器壓力206.7 kPa，毛細(xì)管電壓3500 V，錐孔電壓65 V，采集范圍1000～4000 m/z.

1.3 TTR蛋白溶液的配制

甲狀腺素運載蛋白用超純水溶解，配成100 μmol/L的母液，四溴雙酚A用DMSO溶解，配成100 mmol/L母液，置于冰箱中，4℃保存、備用.

用微量移液器取5 μL TTR母液，以pH 7.4的醋酸銨緩沖溶液為溶劑，將蛋白母液稀釋至50 μL，得10 μmol/L的TTR稀釋液，待測.將待測液置于離心機(jī)5000 g離心10 min，取上層液進(jìn)ESI-MS檢測.

1.4 TTR和TBBPA的孵育實驗

用微量移液器取10 μL TTR蛋白母液，加入80 μL 10 mmol/L pH 7.4的醋酸銨緩沖液，10 μL 1 mmol/L的TBBPA溶液(由體積比為1︰1的DMSO、超純水稀釋TBBPA母液稀釋100倍)，最終TTR濃度為10 μmol/L，TBBPA濃度為100 μmol/L，將混合液振蕩、混勻，置于搖床37℃恒溫水浴，孵育2 h.將孵育后的溶液置于離心機(jī)5000 g離心10 min，取上層液進(jìn)ESI-MS檢測.

2 結(jié)果與討論

2.1 TTR蛋白的ESI-MS檢測

TTR蛋白的ESI-MS檢測發(fā)現(xiàn)，電噴霧離子源溫度和裂解電壓的升高有助于總體質(zhì)譜信號的增強(qiáng)，但是會造成TTR四聚體的裂解，因此需要探索ESI條件以獲得TTR最少裂解的最高質(zhì)譜信號，并在這個條件下檢測TTR與TBBPA形成的蛋白復(fù)合物.

2.1.1 電噴霧離子源溫度的影響

電噴霧離子源中干燥氣溫度是質(zhì)譜離子源部分重要的參數(shù)之一，合適的溫度條件可較好地保持蛋白質(zhì)的天然活性結(jié)構(gòu).圖1是在不同干燥氣溫度條件下(裂解電壓175V, 其他條件不變)得到的甲狀腺素運載蛋白的電噴霧質(zhì)譜圖.圖1中，高質(zhì)荷比部分是TTR四聚體的多電荷峰，低質(zhì)荷比部分是TTR單體多電荷峰.當(dāng)溫度為240℃時，由峰強(qiáng)可見其基本保持了甲狀腺素運載蛋白的天然四聚體狀態(tài)，僅有少部分蛋白解離為單體.當(dāng)溫度升高至270℃時，單體多電荷峰的強(qiáng)度明顯增加，說明隨著溫度的增加，部分四聚體解離為單體.在300℃時，質(zhì)譜檢測到的幾乎全是單體蛋白質(zhì)峰，說明大多數(shù)四聚體蛋白質(zhì)在高溫下已解離為單體.

monomer: 單體; tetramer: 四聚體圖1 不同干燥氣溫度下TTR的ESI-MS圖Fig.1 The ESI-MS spectra of TTR at different drying gas temperatures

2.1.2 電噴霧離子源裂解電壓的影響

電噴霧離子源部分的裂解電壓是影響甲狀腺素運載蛋白多電荷分布的重要因素之一.圖2是在不同裂解電壓條件下(干燥氣溫度240℃，其他條件不變)甲狀腺素運載蛋白的電噴霧質(zhì)譜圖.由圖2可見，當(dāng)裂解電壓為175 V時，所得基本為TTR四聚體多電荷峰，隨著裂解電壓的增加，TTR四聚體逐漸解離為單體.當(dāng)裂解電壓為325 V時四聚體幾乎全部解離為單體.

圖2 不同裂解電壓下TTR的ESI-MS圖Fig.2 The ESI-MS spectra of TTR at different fragmentor voltage conditions

2.2 TBBPA與TTR復(fù)合物的ESI-MS檢測

選擇合適的儀器條件是測定蛋白質(zhì)復(fù)合物的關(guān)鍵，參考前述電噴霧質(zhì)譜研究甲狀腺素運載蛋白的各質(zhì)譜參數(shù)，選擇實驗條件觀察檢測TBBPA-TTR蛋白質(zhì)復(fù)合物的多電荷質(zhì)譜峰.在較溫和的溫度、裂解電壓等條件下雖能測得蛋白質(zhì)復(fù)合物峰，但由于去溶劑效果不好，加合較多的水分子而令質(zhì)譜圖變寬，靈敏度降低.故優(yōu)化實驗條件，尤其是離子源部分的參數(shù)，以更好地脫去溶劑，保持蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的完整性.

圖3是TTR和TBBPA孵育后在一定的干燥氣溫度和裂解電壓條件下(其他條件不變)得到的電噴霧質(zhì)譜圖，由圖3a可見原蛋白多電荷峰幾乎消失，得到分別結(jié)合1個TBBPA和2個TBBPA的蛋白質(zhì)復(fù)合物峰.圖3b圖說明了電噴霧質(zhì)譜離子源條件對蛋白質(zhì)復(fù)合物的影響.由圖3b可見，隨著溫度的升高，結(jié)合2個TBBPA的蛋白質(zhì)復(fù)合物大部分已解離，未結(jié)合TBBPA的TTR四聚體峰強(qiáng)度增加，并有部分四聚體解離為單體.但結(jié)合1個TBBPA的蛋白質(zhì)復(fù)合物峰仍有較高的強(qiáng)度，說明該條件下結(jié)合1個TBBPA的蛋白復(fù)合物較穩(wěn)定.

圖3中TBBPA與TTR四聚體結(jié)合可得到不同摩爾比(1︰1, 2︰1)的蛋白質(zhì)復(fù)合物.當(dāng)TBBPA在生物體內(nèi)累積到一定濃度時，可能與TTR蛋白形成復(fù)合物，干擾TTR對甲狀腺素的運輸，導(dǎo)致體內(nèi)甲狀腺素水平降低，引起甲狀腺系統(tǒng)紊亂，表現(xiàn)出TBBPA的內(nèi)分泌干擾毒性.

P: protein; L: ligand 圖3 TTR和TBBPA蛋白復(fù)合物的ESI-MS圖Fig.3 The ESI-MS spectra of TTR-TBBPA protein complex

3 結(jié)語

本文利用電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)檢測了甲狀腺素運載蛋白及其和四溴雙酚A形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物.在不同的質(zhì)譜條件下，甲狀腺素運載蛋白表現(xiàn)出不同的多電荷峰強(qiáng)度及分布，只有在較溫和的干燥氣溫度或裂解電壓條件下，才能獲得較高峰強(qiáng)度的TTR四聚體的多電荷峰.四溴雙酚A和甲狀腺素運載蛋白形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物在不同的干燥氣溫度和裂解電壓下，多電荷峰呈現(xiàn)出不同的峰強(qiáng)度，并能觀察到摩爾比為1︰1和2︰1的蛋白質(zhì)復(fù)合物峰.并證明了電噴霧質(zhì)譜法在蛋白質(zhì)復(fù)合物(蛋白多聚體及蛋白質(zhì)-配體小分子復(fù)合物)研究中的突出優(yōu)勢.

參 考 文 獻(xiàn)

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