夏廣輝， 沈偉健， 余可垚， 吳 斌， 張 睿， 沈崇鈺，趙增運(yùn)， 卞筱泓， 許激揚(yáng)＊

（1.中國藥科大學(xué)生物化學(xué)教研室，江蘇 南京210009；2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局食品實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210001）

蜂蜜和蜂王漿作為主要的蜂產(chǎn)品，具有較高的營養(yǎng)和保健價(jià)值［1］，市場(chǎng)需求較大。但在養(yǎng)殖過程中蜜蜂幼蟲容易染上各種疾病，例如由雅氏瓦螨引起的蜂螨病。幼蟲染病后就會(huì)大量的死亡，給蜂農(nóng)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此蜂農(nóng)就會(huì)對(duì)蜂巢噴灑農(nóng)藥以起到預(yù)防蟲病的作用。目前氟胺氰菊酯是使用最廣泛的抗螨蟲藥，其他的農(nóng)藥如氟氯苯菊酯和氯氰菊酯［2－4］以及有機(jī)磷類農(nóng)藥蠅毒磷［5］等也有一定的使用。農(nóng)藥的不合理使用導(dǎo)致這些農(nóng)藥在殺滅寄生蟲的同時(shí)，往往也會(huì)污染蜂產(chǎn)品。如果長(zhǎng)期食用這些被農(nóng)藥污染的蜂產(chǎn)品，人們的健康將面臨嚴(yán)重的危險(xiǎn)［6，7］。許多國家都規(guī)定了蜂產(chǎn)品中殺蟲劑的最大殘留量（MRL），如美國環(huán)保部規(guī)定蜂蜜中的蠅毒磷的MRL要小于0.1 mg／kg，日本肯定列表規(guī)定蜂蜜中氟胺氰菊酯、氯氰菊酯、氟氯苯菊酯的MRL分別為0.01、0.005、0.05 mg／kg，我國農(nóng)業(yè)部也規(guī)定了蜂蜜中氟胺氰菊酯、氟氯苯菊酯的MRL分別為0.05、0.01 mg／kg。

目前文獻(xiàn)中報(bào)道的用于分析這些農(nóng)藥的檢測(cè)技術(shù) 主 要 有 GC［2，8－10］、GC－MS［11－15］、HPLC［16］、LCMS［17］等。由于色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀器的普及，GC、LC技術(shù)因樣品前處理復(fù)雜、不能定性確證，在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用已經(jīng)越來越少。應(yīng)用LC－MS技術(shù)分析蠅毒磷時(shí)靈敏度高、選擇性好，但是在分析弱極性的氟胺氰菊酯、氯氰菊酯、氟氯苯菊酯等擬除蟲菊酯時(shí)靈敏度較差，尤其分析氟氯苯菊酯的靈敏度很差。GC－MS技術(shù)對(duì)于農(nóng)藥分析具有一定的優(yōu)勢(shì)，尤其近幾年隨著對(duì)化學(xué)電離源（CI）研究的深入，發(fā)現(xiàn)其對(duì)帶負(fù)電的化合物具有高靈敏度，且對(duì)絕大部分基質(zhì)組分和柱流失均無響應(yīng)［14］，使得化學(xué)電離源在農(nóng)藥殘留分析中具有很高的價(jià)值。由于本文要分析的目標(biāo)物質(zhì)均含有強(qiáng)電負(fù)性的氰基或鹵族元素，因此選用負(fù)化學(xué)電離源（NCI）技術(shù)分析這些農(nóng)藥尤為合適。蜂王漿成分復(fù)雜，而考察王漿中農(nóng)藥殘留的文獻(xiàn)較少，目前尚未見有文獻(xiàn)采用NCI技術(shù)進(jìn)行蜂蜜和蜂王漿中蠅毒磷、氟胺氰菊酯、氟氯苯菊酯、氯氰菊酯殘留量的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和材料

標(biāo)準(zhǔn)品：蠅毒磷（coumaphos）、氯氰菊酯（cypermethrin）、氟胺氰菊酯（fluvalinate）、氟氯苯菊酯（flumethrin）（德國Dr.Ehrenstorfer公司）。

正己烷、乙腈（色譜純，美國Burdick公司）；乙酸乙酯（色譜純，美國Sigma－Aldrich公司）；氯化鈉（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）；乙二胺－N－丙基硅烷填料（PSA）（40～60目，美國 UCT公司）；C18固相萃取柱（美國Sepax公司）。

1.2 儀器和設(shè)備

Agilent 7890A GC－5975C MS（配有CI源）（美國Agilent公司）；XW－80A旋渦混勻器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；KH－500B超聲儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；BUCHI R－200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）；SIGMA2－16K臺(tái)式離心機(jī)（德國賽多利斯公司）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和工作液的配制

分別準(zhǔn)確稱取10 mg（精確到0.1 mg）蠅毒磷、氯氰菊酯、氟胺氰菊酯、氟氯苯菊酯標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，分別配成1 g／L的農(nóng)藥單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃冰箱中冷藏保存（有效期12個(gè)月）。

分別取1.0 mL農(nóng)藥單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于同一個(gè)10 mL容量瓶中，并用正己烷稀釋至10 mL，配制成100 mg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，依次逐級(jí)稀釋成10、1、0.1 mg／L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4℃冰箱中冷藏保存（有效期6個(gè)月）。

1.4 樣品前處理

1.4.1 蜂蜜

稱取樣品5.0 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入5 mL水和5 g氯化鈉，渦旋2 min溶解；加入25 mL乙酸乙酯，渦旋2 min；超聲提取15 min，于8 000 r／min下離心，吸取上層清液；再用25 mL乙酸乙酯提取1次；合并提取液于150 mL平底燒瓶中，于40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干；加入1 mL正己烷溶解，轉(zhuǎn)移入10 mL試管中，加入50 mg PSA，渦旋2 min，并過0.45μm有機(jī)相濾膜于進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)，待GC－NCI／MS分析。

1.4.2 蜂王漿

準(zhǔn)確稱取5.0 g（精確至0.01 g）均質(zhì)的王漿樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈－水（1∶1，v／v）混合溶劑，超聲提取15 min，于8 000 r／min下離心4 min，取上清液待凈化。

將C18柱安裝在固相萃取裝置上，依次加入4 mL正己烷－乙酸乙酯（1∶1，v／v）混合溶劑、3 mL乙腈、3 mL水進(jìn)行活化；將待凈化的上清液過C18柱，真空抽干；加入4 mL正己烷進(jìn)行洗脫，收集洗脫液于10 mL玻璃試管中，氮?dú)獯蹈?；加? mL正己烷復(fù)溶，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)，待GC－NCI／MS分析。

1.5 氣相色譜條件

色譜柱：HP－5ms彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25mm×0.25μm）；柱溫升溫程序：初始溫度100℃，以20℃／min升至300℃，保持13 min。載氣：高純（純度≥99.999%）氦氣；載氣流速：1.0 mL／min；進(jìn)樣口溫度：300℃；接口溫度：250℃；進(jìn)樣量：1μL；進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣，1.50 min后開分流閥。

1.6 質(zhì)譜條件

離子源：NCI；電離能量：174.7 eV；離子源溫度：150℃；四極桿溫度：150℃；溶劑延遲時(shí)間：4.20 min；反應(yīng)氣：高純（純度≥99.99%）甲烷氣；數(shù)據(jù)采集模式：SIM；離子碎片信息見表1。

表1 4種農(nóng)藥GC－NCI／MS分析的保留時(shí)間、線性方程、相關(guān)系數(shù)、定量和定性離子Table 1 Retention times（tR），linear equations，correlation coefficients（r2），quantification ions，identification ions of the four insecticides by GC－NCI／MS

2 結(jié)果與討論

2.1 提取與凈化

蜂蜜的主要成分有糖類、水分、有機(jī)酸類、維生素類物質(zhì)等［18］。其中糖類物質(zhì)約占75%以上，主要為葡萄糖和果糖，它們均為極性物質(zhì)。蜂蜜中的脂溶性組分如有機(jī)酸等［19］，采用乙酸乙酯提取時(shí)會(huì)進(jìn)入萃取液，給農(nóng)藥的準(zhǔn)確分析帶來干擾。PSA可以吸附這些有機(jī)酸，本文方法加入50 mg PSA凈化以消除干擾。

王漿是一類組分較復(fù)雜的蜂產(chǎn)品，主要成分包括水分、蛋白質(zhì)、糖類、氨基酸、脂肪酸、維生素等物質(zhì)［20，21］。其中蛋白質(zhì)約占12%～15%，且種類有12種以上，此外還有許多小肽類物質(zhì)。蛋白質(zhì)的表面有許多游離的羥基，這些羥基間的鍵合會(huì)使蛋白質(zhì)形成許多囊狀結(jié)構(gòu)。這些囊狀的蛋白質(zhì)分子會(huì)包裹農(nóng)藥分子，從而給農(nóng)藥的準(zhǔn)確定量分析帶來干擾。因此王漿樣品前處理中最關(guān)鍵的步驟就是沉降蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的沉降劑有許多種，如強(qiáng)堿、強(qiáng)酸類的氫氧化鈉、高氯酸、三氯乙酸等，但是這些強(qiáng)堿、強(qiáng)酸在使蛋白質(zhì)變性的同時(shí)，也會(huì)破壞農(nóng)藥結(jié)構(gòu)中的酯鍵，導(dǎo)致農(nóng)藥回收率較低（只有30%～50%）。在分析王漿中4種目標(biāo)農(nóng)藥時(shí)，最常用的沉降劑為有機(jī)溶劑，如乙腈、二氯甲烷、氯仿等，有機(jī)溶劑沉降蛋白質(zhì)的效果很好且不會(huì)破壞基質(zhì)中的農(nóng)藥結(jié)構(gòu)。由于乙腈既可以作為蛋白質(zhì)沉降劑，又可作為提取溶劑，從簡(jiǎn)化操作的目的，本文選擇乙腈為沉降劑。

2.2 線性關(guān)系、檢出限及選擇性

配制50～500μg／L 5個(gè)系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并按上述GC－MS條件進(jìn)行測(cè)定，以農(nóng)藥定量離子的峰面積對(duì)質(zhì)量濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到4種農(nóng)藥的線性方程及相關(guān)系數(shù)，由表1可見方程的線性關(guān)系良好（相關(guān)系數(shù)均大于0.99）。

結(jié)合加標(biāo)水平為10μg／kg的蜂蜜和王漿樣品的總離子流（TIC）譜圖，根據(jù)S／N＝3和S／N＝10確定檢出限和定量限，蜂蜜和王漿中4種農(nóng)藥的檢出限和定量限見表2。4種農(nóng)藥的LOD范圍為0.12～5.0μg／kg，LOQ 為0.40～16.5μg／kg，方法的靈敏度大大低于采用其他技術(shù)如GC、GC－EI／MS、LC 和 LC－MS等的 結(jié)果［8，10，16，17］，且均可 以 滿足對(duì)外貿(mào)易中的檢測(cè)要求。

表2 蜂蜜和王漿兩種基質(zhì)中4種農(nóng)藥的檢出限和定量限Table 2 LODs and LOQs of four insecticides in honey and royal jelly

采用電子轟擊電離技術(shù)分析有較高沸點(diǎn)的氟氯苯菊酯時(shí)，由于受到柱流失的影響，檢測(cè)基線會(huì)抬高，導(dǎo)致檢測(cè)氟氯苯菊酯的靈敏度很差，譜圖中幾乎看不到出峰。由于NCI不會(huì)對(duì)柱流失成分產(chǎn)生響應(yīng)且對(duì)氟氯苯菊酯有特異的響應(yīng)，因此應(yīng)用NCI檢測(cè)蜂蜜和王漿基質(zhì)中氟氯苯菊酯的靈敏度很高。

本文測(cè)定的4種殺蟲劑均含有強(qiáng)電負(fù)性的基團(tuán)，如氟胺氰菊酯、氟氯苯菊酯、氯氰菊酯均含有強(qiáng)電負(fù)性的氰基和鹵族元素氟或氯，蠅毒磷含有強(qiáng)電負(fù)性的氯元素。由于NCI只對(duì)含電負(fù)性基團(tuán)的化合物有響應(yīng)，且隨著電負(fù)性的增強(qiáng)，響應(yīng)增強(qiáng)，因此NCI對(duì)這4種殺蟲劑具有很高的選擇性。而蜂蜜和王漿的基質(zhì)組分無電負(fù)性，在NCI下沒有響應(yīng)，也不會(huì)帶來干擾。如蜂蜜和王漿中10μg／kg加標(biāo)樣的TIC譜圖（圖1c和圖1e）所示，目標(biāo)峰附近都沒有出現(xiàn)干擾峰。

圖1 （a）0.1 mg／L4種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、（b）空白蜂蜜樣品、（c）10μg／kg加標(biāo)水平的蜂蜜樣品、（d）空白王漿樣品和（e）10μg／kg加標(biāo)水平的王漿樣品的總離子色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of（a）a mixed standard solution of the four insecticides（0.1 mg／L），（b）a blank honey sample，（c）a honey sample spiked with the standards at 10μg／kg，（d）a blank royal jelly sample and （e）a royal jelly sample spiked with the standards at 10μg／kg

2.3 準(zhǔn)確度與精密度

在陰性的蜂蜜和王漿樣品中分別添加10、15和20μg／kg 3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述提取、凈化和檢測(cè)步驟，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次。依據(jù)測(cè)得濃度和加標(biāo)濃度的比值計(jì)算4種農(nóng)藥的平均回收率并計(jì)算RSD。

處理王漿樣品時(shí)，蛋白質(zhì)的沉降有時(shí)候不是很徹底，殘留的蛋白質(zhì)仍會(huì)包裹農(nóng)藥分子，再加上前處理過程中的其他因素均會(huì)導(dǎo)致農(nóng)藥的損失。本文分別采用溶劑校正曲線和萃取液校正曲線來計(jì)算加標(biāo)水平為10μg／kg的王漿樣品中4種農(nóng)藥的回收率，結(jié)果如圖2所示，蠅毒磷和氯氰菊酯采用溶劑校正曲線計(jì)算得到的回收率都在50%以下，而采用萃取液校正曲線得到的結(jié)果可以達(dá)到80%以上；很顯然，采用萃取液校正曲線計(jì)算王漿中4種農(nóng)藥的回收率更為準(zhǔn)確，王漿中4種農(nóng)藥的平均回收率在78.2%～93.1%之間，且RSD≤12.2%（見表3）。

圖2 采用兩種校正曲線計(jì)算10μg／kg王漿樣品中4種農(nóng)藥的回收率Fig.2 Recoveries of the four insecticides spiked in royal jelly at 10μg／kg calculated by two kinds of calibration curves

表3 3個(gè)添加水平下4種農(nóng)藥在蜂蜜和王漿樣品中的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝6）Table 3 Average recoveries and the relative standard deviations of the four insecticides spiked in honey and royal jelly at three levels（n＝6）

與王漿相比，蜂蜜基質(zhì)組成較為簡(jiǎn)單且前處理操作過程也較為簡(jiǎn)單，采用溶劑校正曲線計(jì)算蜂蜜中4種農(nóng)藥的回收率，平均回收率在79.2%～110.0%之間，且RSD≤13.1%（見表3），結(jié)果令人滿意，因此在計(jì)算蜂蜜中4種農(nóng)藥的回收率時(shí)，采用溶劑校正曲線即可滿足殘留分析要求。

3 結(jié)論

本文應(yīng)用GC－NCI／MS技術(shù)測(cè)定了蜂蜜和王漿中的蠅毒磷、氟胺氰菊酯、氟氯苯菊酯、氯氰菊酯的殘留量。4種農(nóng)藥在兩種基質(zhì)中的LOD范圍在0.12～5.0μg／kg，LOQ 為0.40～16.5μg／kg之間。在10、15、20μg／kg添加水平下，4種農(nóng)藥的平均回收率在78.2%～110.0%之間，且RSD均小于14%。本方法具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、選擇性好、抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)，可以成為檢測(cè)蜂蜜、王漿中該4種農(nóng)藥的常規(guī)檢測(cè)技術(shù)，且滿足國際貿(mào)易檢測(cè)要求。

［1］ Majtan J，Kumar P，Majtan T，et al.Exp Dermatol，2010，19（8）：73

［2］ Mukherjee I.Bull Environ Contam Toxicol，2009，83（6）：818

［3］ Girisgin A，Aydin L.Uludag Bee J，2010，10（2）：70

［4］ Choudhary A，Sharma D，Badiyala A.Pestic Res J，2009，21（1）：67

［5］ Karazafiris E，Tananaki C，Menkissoglu－Spiroudi U，et al.Pestic Manag Sci，2008，64（2）：165

［6］ Johnson R M，Ellis M D，Mullin C A，et al.Apidologie，2010，41（3）：312

［7］ Smodis Skerl M I，Nakrst M，Zvokelj L，et al.Acta Vet Brno，2011，80（1）：51

［8］ Sharma D，Nagpal A，Pakade Y B，et al.Talanta，2010，82（4）：1077

［9］ Jiménez J，Bernal J，del Nozal M J，et al.J Chromatogr A，2001，919（1）：147

［10］ Li X B，Zhao M，Li S Q，et al.Chinese Journal of Chromatography（李賢波，趙蔓，李勝清，等.色譜），2012，30（9）：926

［11］ Shinger M I，Elbashir A A，Ahmed H E，et al.Biomed Chromatogr，2012，26（5）：589

［12］ Shen W J，Cao X W，Liu Y J，et al.Chinese Journal of Chromatography（沈偉健，曹孝文，劉一軍，等.色譜），2012，30（11）：1172

［13］ Li H Y，Zhang Q，Kang S Y，et al.Chinese Journal of Chromatography（李海玉，張慶，康蘇媛，等.色譜），2012，30（6）：596

［14］ Nguyen T D，Lee M H，Lee G H.Microchem J，2010，95（1）：113

［15］ Shen C Y，Cao X W，Shen W J，et al.Talanta，2011，84（1）：141

［16］ Martel A C，Zeggane S.J Chromatogr A，2002，954（1）：173

［17］ Chung S W，Lam C.Anal Bioanal Chem，2012，403（3）：885

［18］ Ball D W.J Chem Educ，2007，84（10）：1643

［19］ Ramanauskiene K，Stelmakiene A，Briedis V，et al.Food Chem，2012，132（3）：1544

［20］ Sabatini A G，Marcazzan G L，Caboni M F，et al.J ApiProd ApiMed Sci，2009，1（1）：1

［21］ Daniele G，Casabianca H.Food Chem，2012，134（2）：1025