丘忠麗， 林 纓， 熊志立， 謝劍煒＊

（1.抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京100850；2.沈陽藥科大學藥學院，遼寧 沈陽110016）

胍丁胺（agmatine，Agm）是精氨酸在細胞線粒 體膜上左旋精氨酸脫羧酶（L－arginine decarboxy－lase，L－ADC）催化作用下的脫羧產物。1994年Li等［1］首次從哺乳動物體內成功分離檢測到胍丁胺。內源性胍丁胺及其相應受體可能在中樞神經系統(tǒng)內構成了阿片功能的調節(jié)系統(tǒng)［2］。外源性胍丁胺具有增強嗎啡鎮(zhèn)痛、降低其成癮性和抗耐受作用［3］以及明顯的抗抑郁、抗焦慮作用［4］，能夠抑制阿片依賴和復吸［5］，而內源性胍丁胺在阿片依賴發(fā)生發(fā)展中的作用尚屬未知。內源性胍丁胺的高靈敏度、高特異性分析方法的建立，對于監(jiān)測內源性胍丁胺在生物體內的變化，進而闡明內／外源性胍丁胺作為候選神經遞質的基本生物學特征以及在阿片依賴和復吸發(fā)生發(fā)展中的作用具有重要意義。

胍丁胺無紫外和熒光吸收，極性大，自身難以氣化，因此在常規(guī)的氣相色譜、液相色譜及其聯(lián)用質譜上均難以直接檢測，現有的檢測方法主要通過衍生化反應來實現。目前文獻報道的檢測方法主要有高效 液 相 色 譜 法 （HPLC）［6－11］、氣 相 色 譜 法（GC）［12－14］、毛細管電泳法［15，16］和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）［17］等。其中，HPLC 常用衍生化試劑如鄰苯二 甲 醛－β－巰 基 乙 醇 （OPA－ME）［6，7］、萘 二 甲 醛（NDA）［8］等衍生化后，采用熒光［6－8，10］或質譜［11］檢測器檢測，但由于衍生化后造成基底干擾嚴重，不適用于復雜基質中胍丁胺的高靈敏檢測。GC和GCMS是較常用的檢測方法。Kawabata等［12］對比了不同的衍生化試劑包括乙酰丙酮（AA）、三氟乙酰丙酮（TFAA）以及六氟乙酰丙酮（HFAA）的衍生化效果，結果發(fā)現，乙酰丙酮類化合物能夠與胍類進行特異性的衍生化反應，胍丁胺與HFAA衍生化反應的產率最高，產物揮發(fā)度高，且穩(wěn)定性最好，是采用GC或GC－MS檢測胍丁胺的最佳衍生化試劑（胍丁胺、HFAA及其衍生化產物的推測結構式見圖1）。因此，目前基于GC技術分離檢測胍丁胺的方法均采用HFAA衍生化，通過與質譜檢測器聯(lián)用能夠獲得較高的檢測靈敏度。

由于穩(wěn)定性同位素與被測組分化學結構相同，僅個別元素是質量不同的同位素，因此二者的理化性質非常接近，能充分發(fā)揮內標在樣品預處理及色譜行為中的校正作用。穩(wěn)定同位素已成為質譜檢測器檢測時的理想內標。劉瀟等［18］測定人血清中的多溴聯(lián)苯，劉芷彤等［19］分析環(huán)境樣品中的多氯萘，均使用了同位素內標。王海龍等［20］以d8－胍丁胺為內標，采用液相色譜－電噴霧離子阱質譜直接檢測大鼠尿中的胍丁胺原型及乙?；x產物，該方法不需衍生化，操作流程簡單，但未見有效的方法學數據。Chen等［14］以15N4－胍丁胺為內標，HFAA 衍生化后采用GC－NCI／MS檢測。該方法檢出限低達0.01 ng／g（濕重）（計算值），但是需經過兩次液液萃取，樣品前處理較為繁瑣。

圖1 胍丁胺（Agm）、內標（d8－Agm）、胍丁胺與六氟乙酰丙酮（HFAA）衍生化預測產物的結構式［15，16］Fig.1 Structures of agmatine（Agm），internal standard d8－Agm and the predicted derivatives of Agm with hexafluoroacetone（HFAA）

本文建立了大鼠血漿中內源性胍丁胺的GCNCI／MS分析方法。以穩(wěn)定同位素標記的d8－胍丁胺為內標，大鼠血漿樣品經蛋白沉淀后直接采用HFAA衍生化，Florisil固相萃取柱凈化，選擇離子模式監(jiān)測。所建立的方法簡便快捷、特異性好、靈敏度高，能夠應用于大鼠血漿中內／外源性胍丁胺生理功能的研究。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

氣相色譜－質譜聯(lián)用儀（Agilent 6890N GC－Agilent 5975MSD，Agilent公司，美國），配備化學電離源（CI）、自動進樣器及數據處理工作站；固相萃取裝置（Waters公司，美國）；固相萃取小柱（Alltech公司，美國）；2 mL頂空瓶、頂空瓶手動封蓋器（Gerstel公司，德國）；弗羅里硅土（Florisil）填料（Alltech公司，美國）。

HFAA（純度≥98%，Sigma公司，美國）；胍丁胺硫酸鹽（純度≥99.9%）、d8－胍丁胺硫酸鹽（純度≥95%）均由軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所藥物合成實驗室提供。甲醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯（色譜純，Duksan Pure Chemicals公司，韓國）；實驗用水均經超純水系統(tǒng)處理；分析純醋酸銨購于國藥集團北京化學試劑公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 GC－MS條件

GC條件：色譜柱為HP－5MS毛細管柱（25 m×0.20 mm×0.33μm，Agilent公司，美國）；載氣為氦氣，恒流模式，流速為1 mL／min；進樣口溫度為260℃；傳輸線溫度為280℃；色譜柱升溫程序：起始溫度80℃，保持1 min，以20℃／min升至280℃，保持1 min；進樣體積為1μL，不分流進樣，保持0.3 min。

MS條件：離子源為CI，負離子模式檢測；離子源溫度為150℃；反應氣為甲烷；溶劑延遲時間為7 min；監(jiān)測離子為m／z 492（胍丁胺衍生物的分子離子峰）和m／z 500（d8－胍丁胺衍生物的分子離子峰）。

1.2.2 胍丁胺標準儲備液和工作溶液的配制

精密稱取胍丁胺硫酸鹽10.0 mg，用超純水配制成1.00 mg／mL的儲備液；再將儲備液用超純水稀釋至20μg／mL后，用50 mmol／L醋酸銨甲醇溶液逐級稀釋成285、57.0、28.5、11.4、2.85、1.14、0.570、0.285、0.114、0.057 ng／mL的系列標準工作溶液。

1.2.3 內標d8－胍丁胺的配制

精密稱取d8－胍丁胺硫酸鹽17.2 mg，用D2O定容配制成1.72 mg／mL的內標儲備液，再將儲備液用乙腈稀釋為50 ng／mL的工作液。

1.2.4 質控樣品溶液的配制

將胍丁胺儲備液逐級稀釋成42.8、28.5、2.85 ng／mL的標準質控溶液，分別取50μL，加入50 ng／mL的內標溶液25μL，氮吹揮干后，依次加入大鼠血漿100μL即得。

1.2.5 血漿樣品前處理

取100μL大鼠血漿，加入100μL甲醇，超聲5 min，渦旋混勻后再加入800μL乙腈，超聲5 min，渦旋混勻，于14 000 r／min下離心15 min。轉移上清液至2 mL鉗口瓶中，于45℃下蒸干，待衍生化反應。

1.2.6 衍生化過程

將鉗口瓶置于冰上，準確加入50μL HFAA和50μL乙腈，用封蓋器封蓋，超聲5 min，混勻，于100℃條件下反應90 min。反應后將其冷卻至室溫，于45℃條件下用氮氣吹干，用200μL乙酸乙酯復溶。

1.2.7 衍生化產物的凈化

將填裝有500 mg Florisil填料的3 mL固相萃取柱置于固相萃取儀上，依次用2 mL二氯甲烷清洗、2 mL正己烷活化，將200μL乙酸乙酯復溶液上樣于固相萃取柱，靜置10 min，抽干。用500μL正己烷潤洗鉗口瓶后二次上樣，靜置10 min，抽干。用2.5 mL二氯甲烷洗脫，收集洗脫液，徹底抽干。洗脫液于45℃條件下蒸干后，用100μL二氯甲烷復溶，取1μL進樣。

2 結果

2.1 方法專屬性

胍丁胺及內標d8－胍丁胺標準品衍生物在全掃描模式下的典型質譜圖如圖2所示。添加內標的空白溶劑及大鼠血漿樣品中胍丁胺衍生物的選擇離子監(jiān)測色譜圖如圖3所示。由此可知，在本實驗所采用的色譜條件下，胍丁胺和內標衍生物的保留時間分別為8.08、8.06 min；胍丁胺衍生物的峰形良好，無內源性雜質峰或衍生化副產物干擾。同位素內標中不含胍丁胺（氘代率接近100%），本方法具有良好的專屬性。

圖2 （a）胍丁胺和（b）d8－胍丁胺標準品衍生物在SCAN模式下的典型質譜圖Fig.2 MS spectra of（a）agmatine and（b）d8－agmatine standard derivatives in SCAN mode

2.2 胍丁胺標準品溶液的線性范圍和檢出限

在 質 量 濃 度 分 別 為 285、57.0、11.4、1.14、0.570、0.285、0.114、0.057 ng／mL的100μL標準溶液中分別加入50 ng／mL的內標溶液50μL，揮干并衍生化后測定，以胍丁胺的質量濃度x（ng／mL）為橫坐標，胍丁胺衍生物和內標衍生物的峰面積比值y為縱坐標繪制工作曲線，得到胍丁胺的回歸方程為y＝0.015 2x－0.018 9，r＝0.998，線性范圍為0.057～285 ng／mL。檢出限（LOD）為0.005 7 ng／mL（S／N＞3）。

圖3 添加內標d8－Agm的（a）空白溶劑和（b）大鼠血漿樣品衍生物的SIM色譜圖Fig.3 SIM chromatograms of the derivatives of（a）d8－Agm spiked in blank solvent and（b）Agm and d8－Agm spiked in rat plasma

2.3 血漿加標樣品的線性范圍

在質量濃度為57.0、28.5、11.4、5.70、2.85、1.14 ng／mL的100μL標準溶液中分別加入50 ng／mL的內標溶液25μL，揮干后，加入100μL大鼠血漿，渦旋混勻，沉淀蛋白并衍生化后測定。以胍丁胺的加標質量濃度x（ng／mL）為橫坐標，將胍丁胺衍生物和內標衍生物的峰面積比值扣除空白血漿中胍丁胺衍生物和內標衍生物的峰面積比值，并將該值y作為縱坐標繪制工作曲線，得到胍丁胺的回歸方程為y＝0.014 0 x－0.066 5，r＝0.997，線性范圍為1.14～57.5 ng／mL。

2.4 血漿樣品測定的精密度

配制質量濃度為2.85、28.5、42.8 ng／mL的胍丁胺質控樣品，衍生化并測定。每一濃度進行6份樣本分析，連續(xù)測定3日，計算本方法的精密度，結果見表1。結果顯示，3個濃度的質控樣品的日內相對標準偏差和日間相對標準偏差均小于15%，符合生物樣品定量檢測的要求。

表1 大鼠血漿中胍丁胺測定方法的日內、日間精密度Table 1 Precisions（intra－day and inter－day RSDs）of the method for the determination of agmatine in rat plasma

2.5 血漿樣品的穩(wěn)定性

將低、中、高3個加標濃度的血漿樣品處理后于4℃下放置24 h、室溫下放置4 h以及血漿樣品于－20℃凍融循環(huán)3次，考察穩(wěn)定性。結果如表2所示，在上述條件下放置不影響胍丁胺在血漿中的穩(wěn)定性。另外，由于復溶溶劑是二氯甲烷，具有易揮發(fā)性，因此短期內不進行分析的樣品應放入4℃冰箱內保存。

表2 不同條件下血漿樣品的穩(wěn)定性（n＝3）Table 2 Stability of rat plasma sample under different storage conditions（n＝3）

2.6 血漿樣品中的回收率和基質效應

將血漿樣品進行蛋白沉淀處理后分別添加低、中、高3個濃度的胍丁胺標準溶液，衍生化并檢測。每一濃度進行6個樣本的分析。與質控樣品比較，計算胍丁胺在血漿中的回收率。同時將空白血漿基質配制質控樣品的測定響應值與同濃度的標準溶液響應值相比較，計算基質效應。結果見表3，可見3個添加濃度下胍丁胺的回收率介于92.3%與108.8%之間，生物樣品的基質效應在72.1%～92.7%范圍內。

表3 血漿中胍丁胺的加標回收率及基質效應（n＝6）Table 3 Recoveries and matrix effects of agmatine spiked in rat plasma（n＝6）

2.7 實際生物樣品檢測

取SD大鼠10只（雌、雄各5只），眼眶取血；全血置于肝素化離心管中，于3 000 r／min下離心10 min得血漿。按所建立的方法處理血漿樣品，衍生化后進樣測定，計算得出血漿中內源性胍丁胺的平均質量濃度為（22±9）ng／mL；另外，雌、雄大鼠血漿中胍丁胺含量水平無顯著性差異（p＞0.05）。

3 討論

在HFAA衍生化過程中，用吡啶作為催化劑時衍生化產率較高，但副產物較多，且對毛細管柱損害較大。我們在此基礎上進行優(yōu)化，采用乙腈作為反應溶劑，并優(yōu)化衍生化條件，采用固相萃取方法凈化產物，結果得到較大的改善。

胍丁胺與HFAA衍生化反應后，衍生產物與胍丁胺相比降低了氣化溫度，使其可以在氣相色譜上達到良好的分離檢測，同時反應后產物成環(huán)，增加了產物的穩(wěn)定性。負離子化學電離源屬于軟電離，對含電負性基團的化合物具有高選擇性和高靈敏度。胍丁胺與HFAA的衍生化產物的化學結構中有12個強電負性的氟原子，因此采用氣相色譜－負化學電離質譜可實現對產物的高靈敏度檢測。

4 結論

本文以穩(wěn)定同位素標記的d8－胍丁胺為內標，建立了大鼠血漿中內源性胍丁胺的同位素稀釋－氣相色譜－負離子化學電離質譜分析方法。HFAA衍生化后的胍丁胺血漿樣品經Florisil固相萃取柱可得到有效凈化。方法簡便快速、特異性好、靈敏度高，已應用于大鼠血漿中內源性胍丁胺的定量檢測。

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