劉艷華，趙忠桂，蕭 赪

（湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 湖南 衡陽421001）

大頭艾納香總黃酮類化合物提取工藝研究

劉艷華，趙忠桂，蕭 赪

（湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 湖南 衡陽421001）

目的：為充分利用大頭艾納香植物資源，避免資源的浪費(fèi)，探討大頭艾納香提取物中總黃酮的提取工藝.方法：采用超聲波提取法從大頭艾納香中提取總黃酮類物質(zhì)，通過正交與單因素實(shí)驗(yàn)，確定了大頭艾納香中總黃酮類物質(zhì)提取的最佳工藝.結(jié)果：通過正交與單因素實(shí)驗(yàn)得到的工藝最佳條件是：濃度為65%乙醇，固液比為l:20，超聲波時(shí)間30m in，總提取3次,浸泡24h.在這種條件下，提取率最高，總黃酮得率可達(dá)4.417%.結(jié)論：這種提取工藝重現(xiàn)性好，簡單可行，對(duì)工藝進(jìn)一步的開發(fā)有很好的參考價(jià)值.

超聲波提取；大頭艾納香；總黃酮

大頭艾納香菊科艾納香屬多年生攀援灌木，分布于福建、臺(tái)灣、江西、湖南、廣東、廣西、四川、貴州、云南等省區(qū).

大頭艾納香資源豐富，全草含黃酮，其性微苦、淡，微溫，有祛風(fēng)除濕，活血調(diào)經(jīng)的功能，主治風(fēng)濕骨痛，跌打腫痛，產(chǎn)后血崩，月經(jīng)不調(diào)等癥狀，具有廣泛開發(fā)利用價(jià)值.研究表明，黃酮類化合物為大頭艾納香植物的有效成分之一，目前有關(guān)大頭艾納香中總黃酮的提取方法尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，為合理開發(fā)和利用這一藥用植物資源，利用超聲法提取大頭艾納香中總黃酮，通過正交與單因素試驗(yàn)確定了提取的最佳工藝條件，為進(jìn)一步的開發(fā)利用提供依據(jù).

1 儀器與試劑

1.1 儀器

KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；101-2型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海南陽儀器有限公司）；WFH-203三用紫外分析儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；SHB-IV循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)（2004（C）北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；800型臺(tái)式離心機(jī)(上海浦東物理光學(xué)儀器廠)；電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司).

1.2 試劑

甲醇AR；乙醇AR；石油醚AR；橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；新鮮大頭艾納香植株采自廣西桂林臨桂縣.

2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

2.1 制備樣品溶液[1]

將大頭艾納香枝葉粉碎并過40目篩，兩次用1:10的石油醚進(jìn)行回流脫脂，每次回流脫脂時(shí)間為2h，抽濾，洗滌，然后放入40℃的鼓風(fēng)烘箱中干燥1h左右，備用.

稱取1.Og備用大頭艾納香粉末，加入25mL甲醇，搖勻，密塞，稱其質(zhì)量.超聲波提取30min，放冷后，稱定其質(zhì)量，再用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，取出上清液5mL，甲醇定容至50mL，即可以得樣品液.

2.2 制備對(duì)照品溶液

稱取橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品0.0050g，用甲醇將其定容至50mL，就可得濃度為0.10mg/mL蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)溶液.

2.3 波長的測(cè)定

分別取l.0mL對(duì)照品和l.0mL樣品溶液于10mL容量瓶中，用甲醇進(jìn)行稀釋至刻度，于200～500nm處進(jìn)行掃描，兩者均在280nm附近有最大吸收峰，因此試驗(yàn)中選擇測(cè)定的波長為280nm.

2.4 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密吸取橙皮苷對(duì)照液（0.10mg/mL）0.00，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00mL于10.00mL容量瓶中，用甲醇進(jìn)行定容，在280nm處測(cè)吸光度.其吸光度值見表2.1.

根據(jù)上表得回歸方程：A=2.72×10-2+18.102C，r=0.9979

表2 .1紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度

3 大頭艾納香總黃酮成分的提取

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

用4個(gè)可能影響提取效果的因素做單因素試驗(yàn)即浸泡時(shí)間、乙醇濃度、固液比和超聲時(shí)間.把總黃酮得率作為考察指標(biāo)，確定各個(gè)因素的合適范圍.考察其中一個(gè)因素對(duì)大頭艾納香總黃酮得率的影響時(shí)，其他因素固定.

3.1.1 浸泡時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影晌

精確稱取6份1.Og已脫脂的大頭艾納香粉末于燒瓶中，用濃度65%乙醇，固液比1:20，分別浸泡不同時(shí)間，超聲時(shí)間30min提取總黃酮，抽濾合并濾液，定容到25ml，取5ml蒸干用甲醇溶解過濾，甲醇定容到50ml，取1.0ml稀釋到lOml，使用紫外分光光度法測(cè)定吸光度，利用回歸方程（見2.4）計(jì)算總黃酮含量.

圖3.1可以得出，隨著延長浸泡時(shí)間，黃酮得率逐漸升高，超過了24h后，對(duì)黃酮得率的影響不大，從而可以確定浸泡時(shí)間最好為24h.

圖3 .1浸泡時(shí)間對(duì)總黃酮提取效率的影響

3.1.2 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響

精確稱取6份1.Og已脫脂的大頭艾納香粉末于燒瓶中，分別用不同濃度的乙醇，固液比1:20，浸泡24小時(shí)，超聲時(shí)間30min提取總黃酮，抽濾合并濾液，定容到25ml，取5ml蒸干用甲醇溶解過濾，甲醇定容到50ml，取1.0ml稀釋到lOml，使用紫外分光光度法測(cè)定吸光度，利用回歸方程（見2.4）計(jì)算總黃酮含量.

圖3 .2乙醇濃度對(duì)總黃酮提取效率的影響

圖3.2可以得出，在乙醇濃度達(dá)到65%之前隨著乙醇濃度的升高，總黃酮得率升高，在乙醇濃度為65%，總黃酮得率達(dá)到最大值，超過65%隨著乙醇濃度的增加，總黃酮得率逐漸變低，主要是因?yàn)?5%乙醇的極性與黃酮類物質(zhì)的極性相似[2]，隨著升高乙醇濃度，部分脂溶性物質(zhì)的浸出增加，從而影響了黃酮類物質(zhì)的浸出.

3.1.3 固液比對(duì)總黃酮得率的影響

精確稱取5份1.Og已脫脂的大頭艾納香粉末于燒瓶中，分別用不同的固液比，濃度65%乙醇，浸泡24小時(shí)，超聲時(shí)間30min提取總黃酮，抽濾合并濾液，定容到25m l，取5ml蒸干用甲醇溶解過濾，甲醇定容到50m l，取1.0ml稀釋到lOml，使用紫外分光光度法測(cè)定吸光度，利用回歸方程（見2.4）計(jì)算總黃酮含量.

一般來說，溶劑用量越大，更有利于黃酮類物質(zhì)的擴(kuò)散，其提取效果就會(huì)越好.但是溶劑用量過大會(huì)給后續(xù)的工作如濃縮帶來不便，同時(shí)已經(jīng)浸出的黃酮對(duì)未浸出的黃酮有協(xié)同浸提作用，溶劑用量過大時(shí)不利于協(xié)同浸提[3].圖3.3可以得出，固液比為l:20時(shí)總黃酮得率最大，所以選取固液比為1:25左右為宜.

圖3 .3固液比對(duì)總黃酮提取效率的影響

3.1.4 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

精確稱取5份1.Og已脫脂的大頭艾納香粉末于燒瓶中，用濃度65%乙醇，固液比1:20，浸泡24小時(shí)，不同的超聲時(shí)間提取總黃酮，抽濾合并濾液，定容到25ml，取5ml蒸干用甲醇溶解過濾，甲醇定容到50ml，取1.0ml稀釋到lOml，使用紫外分光光度法測(cè)定吸光度，利用回歸方程（見2.4）計(jì)算總黃酮含量.

圖3 .4超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取效率的影響

圖3.4表明，超聲時(shí)間30min時(shí)達(dá)到最大值，原因是時(shí)間在30min時(shí)，黃酮類物質(zhì)溶出已達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，再延長超聲時(shí)間，部分熱敏組分可能破壞或者時(shí)間過長溶劑揮發(fā)乙醇濃度降低從而總黃酮得率下降[2].

3.2 正交實(shí)驗(yàn)

精確稱取9份1.Og已脫脂的大頭艾納香粉末于燒瓶中，采用超聲法提取總黃酮，根據(jù)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，改變提取條件（不同乙醇濃度、不同固液比、不同超聲時(shí)間和不同提取次數(shù)）提取，抽濾合并濾液，定容到25ml，取5ml蒸干用甲醇溶解過濾，甲醇定容到50m l，取1.0ml稀釋到lOml，使用紫外分光光度法測(cè)定吸光度，利用回歸方程（見2.4）計(jì)算總黃酮含量，確定超聲提取的最佳工藝見表3.1和表3.2.

表3 .1超聲提取正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

實(shí) 驗(yàn) 號(hào)A B C D總 黃 酮含量(%) 1 1 1 1 1 3.514 2 1 2 2 2 3.818 3 1 3 3 3 3.53 4 2 1 2 3 4.484 5 2 2 3 1 4.334 6 2 3 1 2 3.782 7 3 1 3 2 3.378 8 3 2 1 3 4.096 9 3 3 2 1 3.906 k13.062 3.792 3.797 3.918 k2 3.793 3.469 3.743 4.037極 差R 1.138 0.614 0.056 0.378優(yōu) 水 平A2B2C2D34.2 4.083 3.799 3.659 k3

單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4個(gè)因素對(duì)總黃酮得率的影響大小依次為：乙醇濃度A>固液比B>提取次數(shù)D>超聲時(shí)間C，確定大頭艾納香總黃酮提取的最佳工藝為A2B2C2D3.即濃度65%乙醇，固液比1:20，超聲時(shí)間30min，提取3次，浸泡24h.

3.3 驗(yàn)證提取工藝

為確定最佳工藝的穩(wěn)定性和合理性，稱取1.Og已脫脂的大頭艾納香粉末65%乙醇20倍量提取30min提取3次，合并濾液，濃縮到25m l，精密量取5m l蒸干，甲醇溶解定容至50ml，精密量取1.0ml定容至10ml，用紫外分光光度法測(cè)定總黃酮含量.平行做5份，含量平均值為4.417%，RSD為1.84%，工藝穩(wěn)定.

表3 .3最佳工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

4 結(jié)論

超聲波提取法有省時(shí)，節(jié)能，提取率高的優(yōu)點(diǎn).因此我們采用超聲法提取大頭艾納香總黃酮，通過正交與單因素實(shí)驗(yàn)得到的最佳工藝為：濃度65%乙醇，固液比l:20，超聲時(shí)間30min，提取3次，浸泡24h.在這些條件下，提取率最高，總黃酮得率可達(dá)4.417%.此工藝實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好，比較簡單，對(duì)一些工藝開發(fā)有很好的參考價(jià)值.

〔1〕楊榮平,壽清耀,王賓豪等.紫外分光光度法測(cè)定復(fù)方補(bǔ)骨質(zhì)緩釋片中補(bǔ)骨脂總黃酮的含量[J].中國藥房,2007,18(9):673-674.

〔2〕朱萬靖,倪培德,江志煒.沙棘果渣中黃酮類化合物最佳提取工藝研究[J].中國油脂,2001,26(1)：35-37.

〔3〕龔建良,李姣娟,陳叢瑾.微波法提取油茶葉總黃酮的工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(35)：11372～11374.

TQ461

A

1673-260X（2014）07-0068-03

衡陽市科技局基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2012KJ36(衡科發(fā)[2012]75號(hào))）；湖南省教育廳高?？蒲许?xiàng)目（12C1059(湘教通[2012]596號(hào))）