周 剛 丁 紅 宋宏春

(1.內(nèi)蒙古食品藥品檢驗(yàn)所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020;2.呼和浩特市藥品不良反應(yīng)和藥物濫用監(jiān)測(cè)中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020;3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

朱布仁-7是由黑冰片、硼砂、膽南星、苦地丁、連翹、自貝齒、石榴7味藥組成的蒙藥制劑，具有消炎利膽的功效，臨床上主要用于膽痞?。?］。為了有效控制其成品的質(zhì)量，本文對(duì)朱布仁-7的微生物限度檢查參照中國(guó)藥典［2］的規(guī)定進(jìn)行了方法學(xué)研究，確立了可行的微生物限度檢查法。

1 試驗(yàn)材料及儀器

1.1 樣品:朱布仁-7由正藍(lán)旗蒙醫(yī)院提供。

1.2 菌種:大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉。

1.3 培養(yǎng)基:營(yíng)養(yǎng)瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂、膽鹽乳糖、營(yíng)養(yǎng)肉湯、改良馬丁、MUG培養(yǎng)基。上述菌種和培養(yǎng)基均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.4 儀器:三洋MLS-3750型高壓滅菌器、三洋 MIR-554恒溫培養(yǎng)箱、梅特勒-托利多PL602-L型電子天平。

2 方法驗(yàn)證

2.1 菌液制備

2.1.1 取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24h大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的肉湯培養(yǎng)物，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液。

2.1.2 取經(jīng)23～28℃培養(yǎng)24～48h的白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)物，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液。

2.1.3 取經(jīng)23～28℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加3～5mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1mL含孢子數(shù)為50～100 cfu的孢子懸液。

2.2 供試品溶液的制備:稱(chēng)取供試品10g，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，作為1:10的供試液。

2.3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

2.3.1 平皿法:取1mL供試品溶液注皿，分別加入5株試驗(yàn)菌，測(cè)定回收率。

2.3.2 培養(yǎng)基稀釋法:取0.2mL供試品溶液注皿，分別加入5株試驗(yàn)菌，測(cè)定回收率。

2.3.3 回收率的測(cè)定方法

2.3.3.1 試驗(yàn)組:常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法取規(guī)定量供試液和50～100cfu試驗(yàn)菌注皿，立即傾注相應(yīng)的培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿，按規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)，測(cè)定其菌數(shù)。

2.3.3.2 菌液組:取與試驗(yàn)組相同的50～100cfu試驗(yàn)菌注皿，以下同試驗(yàn)組，測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

2.3.3.3 供試品對(duì)照組:常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法取規(guī)定量供試液注皿，平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其供試品本底菌數(shù)。

2.3.3.4 回收率計(jì)算公式:回收率應(yīng)不低于70%。

回收率 =【(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)—供試品對(duì)照組平均菌落數(shù))÷菌液組平均菌落數(shù)】×100%

2.3.4 試驗(yàn)結(jié)果:見(jiàn)表1和表2。

表1 平皿法測(cè)定5株試驗(yàn)菌的回收率

表2 培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定3株試驗(yàn)菌的回收率

2.3.5 結(jié)果判斷:從表1可以看出，本品對(duì)白色念珠菌和黑曲霉無(wú)抑菌活性，回收率不低于70%;對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌活性，回收率低于70%，改用培養(yǎng)基稀釋法對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌重新驗(yàn)證。從表2可以看出，用培養(yǎng)基稀釋法可消除其抑菌活性，3種菌回收率均不低于70%。說(shuō)明采用培養(yǎng)基稀釋法可測(cè)定其細(xì)菌數(shù)，采用平皿法可測(cè)定其霉菌和酵母菌數(shù)。

2.4 控制菌檢查方法驗(yàn)證

2.4.1 大腸埃希菌的驗(yàn)證

菌液制備:同前菌液的制備，制備大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌菌液。

試驗(yàn)組:取1:10供試液10mL及10～100 cfu大腸埃希菌加入100 mL膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，依大腸埃希菌檢查法進(jìn)行檢查。

陰性菌對(duì)照組:取1:10供試液10mL及10～100 cfu金黃色葡萄球菌加入100 mL膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，依大腸埃希菌檢查法進(jìn)行檢查。

2.4.2 大腸菌群的驗(yàn)證

菌液制備:同前菌液的制備，制備大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌菌液。

試驗(yàn)組:取1:10供試液 1mL、1:100供試液1mL、1:1000供試液1mL分別加入10mL膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支中，同時(shí)分別加入10～100 cfu大腸埃希菌，依大腸菌群檢查法進(jìn)行檢查。

陰性菌對(duì)照組:取1:10供試液 1mL、1:100供試液1mL、1:1000供試液1mL分別加入10mL膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支中，同時(shí)分別加入10～100 cfu金黃色葡萄球菌，依大腸菌群檢查法進(jìn)行檢查。

2.4.3 試驗(yàn)結(jié)果:大腸埃希菌、大腸菌群方法驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 常規(guī)法控制菌驗(yàn)證結(jié)果

2.4.4 結(jié)果判斷:從上表可以看出，試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，陰性菌對(duì)照組未檢出陰性對(duì)照菌，說(shuō)明本品用常規(guī)法即可檢出大腸埃希菌、大腸菌群。

3 結(jié)論

采用培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定細(xì)菌數(shù)，采用平皿法測(cè)定霉菌和酵母菌數(shù)，采用藥典常規(guī)法檢查控制菌等建立了朱布仁-7的微生物限度檢查方法。

［1］喬桂芳.HPLC法測(cè)定朱布仁-7中苦地丁的含量［J］.中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2011，5:42-43.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［S］.一部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010，附錄ⅩⅢC.