許鑫琦，任躍明，馬素娟，龍敏南，陳清西＊

（1.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門361102；2.國家藥典委員會 北京100061；3.廈門大學(xué)能源研究院，福建 廈門361102）

纖維素是自然界中分布最廣、含量最為豐富的一類多糖，是理想的生物質(zhì)能源，能夠水解天然纖維素的纖維素酶，是一個復(fù)雜的多酶體系.一般認(rèn)為纖維素酶包含3種主要水解酶［1］：外切葡聚糖酶（CBH，EC 3.2.1.91）、內(nèi)切葡聚糖酶（EG，EC 3.2.1.4）和β－葡萄糖苷酶（BG，EC 3.2.1.21）.纖維素被內(nèi)切酶和外切酶水解成纖維二糖和低聚寡糖后，由BG將以上產(chǎn)物水解產(chǎn)生葡萄糖.BG普遍存在于植物、微生物和哺乳動物的腸道中，微生物中的木霉（Trichodermakoningii）、青霉（Penincilliumaurantiogriseum）、黑曲霉（Aspergillusniger）以 及 米 曲 霉 （Aspergillus oryzae）等真菌來源的BG利用方便，其酶學(xué)性質(zhì)被廣泛地研究，對纖維素酶的應(yīng)用起到了有利的支撐.BG在纖維素酶體系內(nèi)含量少，酶活力低，是制約纖維素降解速率的關(guān)鍵酶，因此BG決定了纖維素糖化過程的最終效率.Xin等［2］研究發(fā)現(xiàn)，在廢紙產(chǎn)乙醇發(fā)酵過程中，加入BG后，促進(jìn)糖化并降低了內(nèi)切酶和外切酶所受到的反饋抑制，進(jìn)而加速纖維素的降解和提高乙醇產(chǎn)量，這說明在纖維素利用體系中，增加BG用量的必要性.近些年，BG 的分子生物學(xué)研究不斷深入［3－4］，包括木霉及米曲霉和黑曲霉等絲狀真菌，以及極端微生物如嗜熱菌［5］來源的BG也越來越受到關(guān)注，BG的克隆表達(dá)增加了BG的工業(yè)來源，有利于解決纖維素發(fā)酵產(chǎn)糖過程中所遇到的瓶頸.除了能源，在其他領(lǐng)域，BG一直受到了國內(nèi)外學(xué)者的緊密關(guān)注［6］，如食品、天然產(chǎn)物提取、醫(yī)療以及日用化工［7］等領(lǐng)域BG也得到了有效的應(yīng)用.

本文從自行篩選的灰綠曲霉菌株（Aspergillus glaucusXC－9）的纖維素發(fā)酵液中，分離純化出BG，研究了乙醇等發(fā)酵產(chǎn)物對其催化活性的影響.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

灰綠曲霉（Aspergillusglaucus）是由實驗室篩選得到的、能夠降解纖維素的曲霉菌株［8］.BG由實驗室分離純化.

1.2 實驗方法

BG的分離純化：灰綠曲霉發(fā)酵液先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%（NH4）2SO4沉淀除雜蛋白，再用70%（NH4）2SO4沉淀BG，離心收集沉淀，溶于適當(dāng)體積的0.02mol／L pH 5.0HAc－NaAc緩沖液中.選用Sephadex G－100凝膠進(jìn)行柱層析，柱床為1.5cm×65cm，洗脫液為0.02 mol／L pH 5.0HAc－NaAc（含0.1moL／L NaCl），流速為1mL／min，自動收集器收集洗脫液，合并活力峰，接著進(jìn)行Phenyl Sepharose Fast Flow疏水層析，柱床為1.6cm×20.0cm.疏水層析洗脫 A液為含0.4mol／L NaCl的0.1mol／L pH 7.8Tris－HCl緩沖液，B液為0.1 mol／L pH 7.8Tris－HCl緩沖液；高鹽上樣，A 液沖平后，用200mL A液和200mL B液進(jìn)行線性梯度洗脫，洗脫流速0.5mL／min，自動收集器收集樣品，每管收集5mL.檢測洗脫液的蛋白濃度和酶活力，合并活力峰.進(jìn)行native－PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，檢測確定所制備的BG為電泳單一純.

酶活力測定參考文獻(xiàn)［9］：50μL酶液加入200μL 0.2mol／L pH 3.6HAc－NaAc緩沖液和250μL 1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）水楊素底物，60℃水浴45min后，再加入2mL 3，5－二硝基水楊酸試劑（DNS）顯色液終止反應(yīng).沸水浴5min后立即冷卻，在酶標(biāo)儀上測A540吸光值.通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得葡萄糖含量.以產(chǎn)生的還原糖量表示酶活力.酶活力定義為在上述條件下每分鐘水解底物產(chǎn)生1μg葡萄糖所需要的酶量.

發(fā)酵產(chǎn)物對BG抑制作用研究：在BG測活力體系里加入不同量的發(fā)酵產(chǎn)物（乙醇，乳酸和乙酸）后，按BG測活力方法測定活力，3次重復(fù)試驗，以發(fā)酵產(chǎn)物濃度對BG剩余活力作圖，考察抑制BG活力的濃度效應(yīng).

發(fā)酵產(chǎn)物抑制機理測定：在測活力體系里，在一定發(fā)酵產(chǎn)物濃度下，改變 BG 質(zhì)量濃度（0.1，0.2，0.3，0.4和0.5μg／mL），按測活力方法測定 BG 的酶活力，用酶活力（μmol／min）對酶質(zhì)量濃度（μg／mL）作圖，得到一組直線，根據(jù)直線的位置關(guān)系判斷各發(fā)酵產(chǎn)物抑制機理.

發(fā)酵產(chǎn)物抑制類型判斷：向測活力體系中加入不同體積的發(fā)酵產(chǎn)物，在每個濃度溶液中改變底物的濃度，測定酶促反應(yīng)的初速率（v），以1／v對1／［cS］雙倒數(shù)作圖，分析比較效應(yīng)物下BG的表觀米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax，根據(jù)雙倒數(shù)曲線圖判定發(fā)酵產(chǎn)物抑制類型，再以Vmax或Km對發(fā)酵產(chǎn)物濃度作圖，測定3個發(fā)酵產(chǎn)物的抑制常數(shù)KI.

含乙醇的反應(yīng)體系中BG最適反應(yīng)溫度的變化及BG分子內(nèi)源熒光測定：向BG測活體系加入不同量乙醇，在不同溫度下測定酶活力，分析比較乙醇體積分?jǐn)?shù)與BG反應(yīng)溫度的關(guān)系.取一定量酶分別在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液（0%、12%、16%、18%、20%，pH 3.6）中60℃水浴15min，冷卻后在VARIAN紫外／可見分光光度計檢測BG內(nèi)源熒光圖譜，熒光發(fā)射峰掃描范圍300～405nm，激發(fā)波長為280nm.

2 實驗結(jié)果

2.1 發(fā)酵產(chǎn)物對酶活力的影響

在BG最適反應(yīng)條件下（pH 3.6，60℃），向測活體系中加入不同體積的乙酸、乙醇和乳酸，研究不同濃度發(fā)酵產(chǎn)物對酶催化水解底物的活力影響.酶剩余活力與之依賴關(guān)系結(jié)果見圖1.隨著各種產(chǎn)物濃度的增大，酶活力迅速下降.乙醇、乙酸、乳酸對酶活力有不同程度抑制，抑制強度依次為乳酸＞乙酸＞乙醇，其半抑制濃度 （IC50）分別為0.09，0.34和4.4mol／L.

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物對酶活力的抑制機理

為判斷以上3種物質(zhì)對BG的抑制機理是否為可逆抑制，分別在含不同濃度乙酸、乙醇和乳酸的測活力體系中，固定底物水楊素濃度為5.0mmol／L，改變酶的加入量，測定不同濃度發(fā)酵產(chǎn)物對酶活力的影響.以酶活力對加入酶量作圖，都得到了一組通過原點的直線（圖2），說明三者對BG的抑制作用都表現(xiàn)為可逆過程，即發(fā)酵產(chǎn)物抑制了酶分子的活性，并未減少有活力的酶量，從而降低BG的催化效率.

圖1 3種發(fā)酵產(chǎn)物對BG活力效應(yīng)Fig.1 Inhibition of fermention products on BG

圖2 3種發(fā)酵產(chǎn)物對BG活力的影響為可逆抑制Fig.2 Reversible inhibition of three fermention products on BG

在BG最適反應(yīng)體系中（pH 3.6，60℃），加入不同體積的乙醇、乙酸或乳酸，在每個濃度的溶液中改變底物的濃度，測定酶促反應(yīng)的初速率（v），以1／v對1／［cS］作圖，結(jié)果如圖3～5所示.雙倒數(shù)作圖均得到一組相交于橫軸的直線（圖3（a），4（a）和5（a））.說明乙醇、乙酸及乳酸對BG不影響米氏常數(shù)（Km），只影響最大反應(yīng)速率（Vm），抑制機理表現(xiàn)為非競爭性類型，可以同時與游離酶（E）和結(jié)合酶（ES）結(jié)合，且結(jié)合常數(shù)相同.以不同濃度效應(yīng)物下測定的1／Vm對效應(yīng)物濃度作圖為一條直線，直線的斜率為1／（Vm·KI）（圖3（b），4（b）和5（b）），從而求得發(fā)酵產(chǎn)物對BG 的抑制常數(shù)分別為乙醇26% （4.25mol／L）、乙酸2% （0.315 mol／L）和乳酸0.7% （0.083mol／L）.

圖3 在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的反應(yīng)體系中BG水解水楊素Lineweaver－Burk曲線Fig.3 Lineweaver－Burk plots for the hydrolysis of salicin by BG in different concentrations of ethanol

圖4 在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的反應(yīng)體系中對BG水解水楊素Lineweaver－Burk曲線Fig.4 Lineweaver－Burk plots for the hydrolysis of saliciny BG in different concentrations of acetic acid

2.3 乙醇對BG反應(yīng)溫度和酶分子內(nèi)源熒光光譜影響

測定了不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對BG催化反應(yīng)溫度的影響，結(jié)果如圖6所示.隨著乙醇濃度的增加，BG催化活力隨之下降的同時，BG水解底物的最適溫度逐漸減小，無乙醇存在下為60℃，當(dāng)乙醇升至20%（體積分?jǐn)?shù)）時，BG的最適溫度已降到了50℃，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加可降低BG最適反應(yīng)溫度.當(dāng)反應(yīng)體系溫度小于55℃，乙醇低于16%時，BG酶活力都高于無乙醇情況下的活力.

最適反應(yīng)條件（60℃，pH 3.6）保存15min后，BG在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液的熒光發(fā)射光譜變化結(jié)果見圖7.在280nm激發(fā)下，天然酶內(nèi)源熒光在338 nm處有特征發(fā)射峰，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于12%時，BG內(nèi)源熒光強度隨乙醇的增加而下降，未發(fā)生紅移；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過12%并繼續(xù)增加時，其強度隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)上升而增強，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)20%時，熒光強度增加了50%，但未發(fā)生紅移，酶分子高級結(jié)構(gòu)還未被完全破壞.

圖5 在不體積分?jǐn)?shù)乳酸的反應(yīng)體系中BG水解水楊素Lineweaver－Burk曲線Fig.5 Lineweaver－Burk plots for the hydrolysis of salicin by BG in different concentrations of lactic acid

3 討 論

圖7 pH3.6不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液60℃處理15min后BG熒光發(fā)射光譜Fig.7 Fluorescence emission spectra of BG after incubating in different concentration of ethanol solutions（pH3.6）for 15min

本文研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物乙醇、乙酸、乳酸對BG活力有不同程度抑制，其IC50分別為4.4，0.34和0.09 mol／L，抑制強度依次為乳酸＞乙酸＞乙醇，乙醇IC50明顯大于前兩者，表明該菌株的BG更適合于纖維素發(fā)酵產(chǎn)乙醇，而且同Aspergillusoryzae［10］產(chǎn)BG相比，乙醇耐受性更高.三者抑制BG均表現(xiàn)為可逆非競爭性抑制，一方面說明發(fā)酵產(chǎn)物以非共價鍵與酶蛋白中的必需基團結(jié)合，除去發(fā)酵產(chǎn)物后而可使酶重新恢復(fù)活性，另一方面，證明乙醇等3種物質(zhì)不結(jié)合在酶活性中心的底物結(jié)合部位上，而是結(jié)合在其以外的必需基團上，所以并不降低酶對底物的親和力，但能阻止酶的催化作用.3種物質(zhì)具有相近的烴骨架，乙醇不像乙酸和乳酸都可解離出H＋，降低酶所處環(huán)境的pH，只是單純靠氫鍵與酶分子發(fā)生反應(yīng)，故抑制作用較后兩者弱.而且，乳酸含有一個羥基和羧基，綜合了乙醇和乙酸的作用，作用比另兩者更強，體現(xiàn)為IC50比乙醇和乙酸低，BG對其耐受度比乙醇或乙酸低.該結(jié)果另一方面驗證羧基化合物比中性羥基化合物更能抑制灰綠曲霉BG活力，故在無氧發(fā)酵中應(yīng)注意控制氧化程度，避免過度產(chǎn)酸.

BG在含乙醇的催化反應(yīng)體系中，熒光強度顯著增大，即分子構(gòu)象改變，酶分子在乙醇溶液中的構(gòu)象變化主要表現(xiàn)為酶分子的主肽鏈從緊密的構(gòu)象趨于松散狀態(tài)，從有序的二級結(jié)構(gòu)變成無規(guī)則線團.可能是因為乙醇介入酶分子中，改變酶分子所處環(huán)境的介電常數(shù)，同時引起肽鏈伸展，構(gòu)象改變，使得Tyr和Trp殘基所處微環(huán)境的極性降低；此外，Tyr殘基形成的氫鍵遭到了破壞，處于淬滅狀態(tài)的Tyr殘基熒光得以恢復(fù)，使其量子率增加，于是熒光強度增大［11］.當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%時，熒光強度顯著增加，但吸收峰波長沒有觀察到顯著的紅移，說明酶分子的整體構(gòu)象尚未完全變性，此時BG還有較大活力.BG在不同量乙醇和不同反應(yīng)溫度的酶活力變化，可能是乙醇和溫度對酶分子綜合作用的結(jié)果.一方面酶的最適反應(yīng)溫度是活性中心活化與分子變性共同作用的結(jié)果，一定量乙醇存在時，由于乙醇作用，隨著溫度上升，酶分子失效加速，故BG合適反應(yīng)溫度比無乙醇時更低.另一方面，溫度較低（＜55℃）時，若乙醇體積分?jǐn)?shù)較低（＜20%），乙醇分子使酶蛋白內(nèi)的次級鍵減弱，酶分子活性中心更加舒展，柔性增加，底物與酶結(jié)合更容易，酶催化效率相應(yīng)地增加；但如果乙醇體積分?jǐn)?shù)較高（20%），乙醇對酶分子的破壞作用占主導(dǎo)，即使溫度降低，酶活力仍然不及前者.

葡萄糖是纖維素酶水解纖維素的最終產(chǎn)物，但在真菌培養(yǎng)或者工業(yè)生產(chǎn)中，葡萄糖常常會在適宜的條件下繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酸或乙醇，這些發(fā)酵產(chǎn)物會對纖維素酶產(chǎn)生反饋抑制，影響酶的活力，以上研究為發(fā)酵進(jìn)程的控制，控制發(fā)酵工藝提供了理論基礎(chǔ).

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