朱可夫 綜述 王寧夫 審校

(浙江中醫(yī)藥大學 杭州市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，杭州浙江 310053)

盡管對于心肌梗死的治療已有了長足的進步，但其仍是全球常見的致死性疾病，而心肌梗死面積是心肌梗死患者高病死率主要的決定因素。因此，限制心肌梗死面積成為了改善患者預(yù)后的重要治療目標。目前，限制心肌梗死面積最有效的方法是早期對病變冠狀動脈使用溶栓和介入進行再灌注治療，以及抗血小板藥物預(yù)防冠狀動脈再次梗塞。而對于再灌注之后二次心肌損傷則成為改善心肌梗死患者預(yù)后的焦點。目前并無有效的藥物應(yīng)用于心肌缺血-再灌注損傷的保護。研究發(fā)現(xiàn)，心肌再灌注損傷與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的開放具有密切聯(lián)系。環(huán)孢霉素A(cyclosporin A，CsA)作為一種強效免疫抑制劑，其對MPTP的開放亦有很強的抑制作用而產(chǎn)生心肌保護效應(yīng)。最近，在歐美國家已有小樣本臨床研究證實其效果，再灌注之前靜注CsA的患者，其心肌梗死面積與對照組相比明顯縮小。許多研究已發(fā)現(xiàn)CsA的心肌保護機制，但其具體機制仍未完全明確。

1 MPTP

心肌缺血-再灌注后通過MPTP的開放和心肌細胞過度收縮引起心肌細胞的死亡[1]。MPTP是線粒體內(nèi)膜上的一種非特異性通道，雖然其分子結(jié)構(gòu)尚未完全知曉，如外膜的電壓依賴性陰離子通道(voltage dependent anion channel，VDAC)和內(nèi)膜的腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運體(adenine nucleotide translocator，ANT)尚存在爭議，但可以肯定線粒體基質(zhì)中的親環(huán)素D(cyclophilin D，CypD)位于其中[2-3]。生理狀態(tài)下，線粒體內(nèi)膜對離子和代謝物質(zhì)無通透性。在心肌缺血期間，MPTP仍處于關(guān)閉狀態(tài)，而在長期缺血后再灌注時，由于基質(zhì)的 Ca2+超載和活性氧的產(chǎn)生使得 MPTP開放。MPTP的開放于再灌注后迅速發(fā)生，這是一個動態(tài)和主動的過程，使得線粒體膜對小分子物質(zhì)[分子量＜1.5 kD(≈1.5×103)]的通透性升高，導(dǎo)致線粒體膜電位去極化、呼吸鏈解偶聯(lián)、激活細胞色素C、凋亡促進因子-1，而后激活caspases凋亡級聯(lián)反應(yīng)和其他凋亡因子。嚴重并長時的損傷導(dǎo)致了ATP耗竭，過多的水分進入線粒體基質(zhì)致其腫脹而后破裂，出現(xiàn)caspase依賴與非依賴的級聯(lián)反應(yīng)使細胞死亡[4-5](圖1)。因此，MPTP與心肌再灌注損傷的關(guān)系成為了心肌保護的重要關(guān)注點。

2 心肌保護與MPTP阻滯劑

目前心肌保護策略之一是使用藥物維持線粒體膜的穩(wěn)定性，例如MPTP阻滯劑CsA在許多動物心肌缺血-再灌注損傷實驗(包括體外和在體實驗)以及臨床ST段抬高性心肌梗死患者的經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)的應(yīng)用。在氧化應(yīng)激的情況下，CsA于線粒體內(nèi)膜和CypD結(jié)合抑制了MPTP的開放，從而維持了線粒體膜的穩(wěn)定性，阻斷細胞色素C的激活以及后續(xù)的凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程，起到了保護心肌的作用(圖1)。

2.1 CsA與心肌細胞容積調(diào)節(jié)有關(guān)

最新研究[6]發(fā)現(xiàn)，CsA的心肌保護作用不僅與阻滯MPTP有關(guān)，而且與心肌細胞容積的調(diào)節(jié)有關(guān)。在缺血預(yù)處理和后處理方面，MPTP于其中的關(guān)鍵作用人們已達成了共識。氯離子是細胞容積調(diào)節(jié)的關(guān)鍵陰離子，而缺血預(yù)處理通過激發(fā)氯離子外流增強了心肌細胞容積調(diào)節(jié)能力。缺血預(yù)處理時，通過阻斷氯離子的跨膜轉(zhuǎn)運阻止了細胞容積的調(diào)節(jié)，此時缺血預(yù)處理的保護作用也被阻斷。因此，可以推測CsA的心肌保護作用機制與氯離子的跨膜轉(zhuǎn)運產(chǎn)生細胞容積調(diào)節(jié)有關(guān)。實驗以兔心臟做缺血-再灌注模型，CsA阻斷MPTP后用茚基氧乙酸阻斷氯離子通道，分別測定細胞損傷、細胞容積和胞內(nèi)氯離子濃度，結(jié)果顯示CsA的心肌保護作用受到顯著抑制。

該實驗未能明確說明CsA激活氯離子通道的機制，也沒能驗證其他離子(如鈉、鈣、鉀離子)的跨膜轉(zhuǎn)運對心肌細胞的影響，但此發(fā)現(xiàn)擴展了人們對CsA的心肌保護機制向其他更廣泛的層面研究。

2.2 緩沖液與CsA均具有心肌保護作用

Duan等[7]發(fā)現(xiàn)，酸性緩沖液(pH 6.8)對心肌缺血-再灌注損傷亦有保護作用。結(jié)果顯示酸性緩沖液與CsA均具有心肌保護作用，阻滯MPTP開放，抑制細胞色素C的釋放，增加了Bcl-2的表達并降低了Bax的表達，從而減少了心肌細胞的凋亡。而Bcl-2和Bax在調(diào)節(jié)心肌凋亡過程中具有重要作用。Bax能直接產(chǎn)生線粒體外膜孔道或者與MPTP開放而提高線粒體通透性，而MPTP的開放又能刺激Bax的釋放形成正反饋。而酸性緩沖液和CsA不僅能阻滯MPTP，還能干擾MPTP與Bax直接的反饋。同時，在病理生理狀態(tài)下，抗凋亡蛋白Bcl-2能阻滯MPTP的開放。然而，該研究數(shù)據(jù)來源于體外動物實驗，而缺血-再灌注能在血液中產(chǎn)生炎癥因子，所以對于其臨床應(yīng)用仍需進一步的實驗研究。

圖1 缺血-再灌注后MPTP的分子模型與CsA的抑制作用

2.3 CsA的心肌保護作用與鈣調(diào)磷酸酶無關(guān)

Leshnower等[8]于2008年驗證了 CsA的心肌保護作用與鈣調(diào)磷酸酶無關(guān)。CsA在與CypD反應(yīng)時，除了能與CypD結(jié)合抑制MPTP的開放，同時還能與親環(huán)素A結(jié)合產(chǎn)生抑制鈣調(diào)磷酸酶的作用。鈣調(diào)磷酸酶對體內(nèi)鈣調(diào)節(jié)的平衡起著重要的作用，并具有促凋亡和抗凋亡的雙重性質(zhì)。雖然關(guān)于CsA的心肌保護作用機制研究已有很多，但仍未清楚認識到其作用過程是僅通過抑制MPTP還是兼有鈣調(diào)磷酸酶。

實驗通過缺血-再灌注動物模型，分CsA組、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(FK506)組和對照組，結(jié)果顯示FK506組無明顯病理損傷減輕，表明CsA的心肌保護作用與鈣調(diào)磷酸酶無關(guān)。國內(nèi)有研究[9]表明，CsA的心肌保護作用不僅是通過阻滯MPTP的開放。因CsA的MPTP阻滯作用可被5-羥基葵酸鹽(5-HD)取消，實驗分設(shè)缺血-再灌注組、CsA組、CsA+5-HD組，結(jié)果顯示CsA組和CsA+5-HD組較缺血-再灌注組CD4+T細胞表達明顯減少，病理損傷程度減輕，表明CsA被取消作為MPTP抑制劑作用后仍能產(chǎn)生心肌保護作用，其機制可能與抑制CD4+T細胞的激活有關(guān)。該實驗提出了CsA不同的機制途徑，擴展了研究思路，但仍未明確T細胞是如何被激活以及具體的心肌保護機制。

3 CsA的動物實驗

3.1 有明顯的心肌保護作用

許多動物實驗(包括鼠、豬、兔)驗證了CsA的心肌保護作用。早在2007年就有一項在體動物實驗證明CsA具有明顯的心肌保護作用[10]。該實驗將SD雄性大鼠阻斷冠狀動脈前降支30 min后復(fù)灌180 min，分別于阻斷冠狀動脈前10 min對實驗組與對照組靜脈注射CsA與生理鹽水，結(jié)果顯示實驗組心肌梗死面積明顯小于對照組。Skyschally等[11]為了減小種屬差異性，以豬為實驗對象，在復(fù)灌前5 min靜脈注射CsA，同時增加了缺血后處理組(20 s再次梗塞與復(fù)灌6個周期)，同樣驗證了CsA和缺血后處理均具有心肌保護作用。Pritzwald-Stegmann等[12]2011年的一項體外動物實驗表明于組氨酸-色氨酸-酮戊二酸鹽液(HTK液)加入低劑量CsA(1 μmol/L)能夠明顯增強心肌收縮力、減少耗氧量。該心肌保護作用模擬了心臟手術(shù)，為心臟手術(shù)時心肌能夠耐受更長時的缺血期提出了新方法。Huhn等[13]在肥胖大鼠上做CsA的心肌保護實驗，發(fā)現(xiàn)肥胖大鼠的心肌梗死面積與對照組無差別，且血糖、膽固醇、三酰甘油均明顯升高，表明在糖尿病前期，CsA的心肌保護作用受到明顯抑制。

3.2 CsA的其他作用

Huang等[14]發(fā)現(xiàn)CsA能提高心臟驟停大鼠的生存率和心臟功能。建立大鼠窒息后心臟驟停模型，CsA于開始復(fù)蘇時和復(fù)蘇后循環(huán)恢復(fù)3 min分別使用，前者左室收縮、舒張功能和心排血量、72 h生存率均顯著高于后者，延遲使用CsA組心肌細胞電鏡下線粒體的完整性和功能均差于復(fù)蘇開始時使用組。雖然該實驗仍需進一步的臨床證據(jù)，但是該結(jié)果拓展了臨床心臟驟?；颊咧委煹男滤悸?。Dhandapany等[15]研究發(fā)現(xiàn)CsA能抑制心肌肥大。心肌肥大與鈣調(diào)磷酸酶的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。而CsA對鈣調(diào)磷酸酶的阻滯作用抑制了RAF1的過度表達，后者能引起肥厚型心肌病發(fā)病率增高。該研究可能為RAF1突變引起的心肌肥大提供新的治療靶點。Troitzsch等[16]建立家兔骨骼肌(背闊肌)缺血-再灌注模型，實驗組和對照組于缺血發(fā)生前10 min分別注射CsA和生理鹽水，實驗組組織氧分壓、高能磷酸鍵水平、線粒體功能均明顯優(yōu)于對照組，表明CsA對骨骼肌亦有很好的保護作用。該實驗為CsA對其他非心肌組織的保護性應(yīng)用提供了廣泛的研究思路和很好的臨床前景。

4 CsA的臨床試驗

Piot等[17]在2008年《新英格蘭雜志》上發(fā)表了一篇關(guān)于CsA心肌保護作用的臨床試驗。試驗?zāi)技?8名急性心肌梗死患者作為志愿者，以心肌缺血時間、缺血面積、射血分數(shù)等為依據(jù)進行分組消減異質(zhì)性。試驗分為CsA組與對照組，在行PCI前分別靜脈注射CsA與生理鹽水，結(jié)果顯示CsA組心肌梗死面積明顯減少。該試驗很好地驗證了CsA對人類心肌梗死后再灌注具有心肌保護作用，但由于樣本量的限制，仍需進一步的大樣本臨床試驗進行驗證。Ghaffari等[18]在一項類似的臨床試驗中獲得了不同的結(jié)果。以101名急性ST段抬高性心肌梗死患者作為實驗對象，試驗方法與之前基本相同，不同點在于Ghaffari是以溶栓作為再灌注的治療方法而非 PCI，結(jié)果顯示CsA不能減少心肌梗死面積和改善預(yù)后。

該次試驗由于樣本量相對較小，可能限制了CsA作用的表現(xiàn)，其次，CsA的使用時相與劑量也未達到最佳效果。另外，試驗只是通過生化指標判斷，并未進行核磁共振成像評價心肌梗死面積(僅通過心肌酶譜推斷心肌梗死面積)。Mewton等[19]以相同的試驗方法對28名心肌梗死患者施行分組并驗證了CsA的作用，同時隨訪6個月觀察CsA心肌功能及心肌重塑的影響。結(jié)果顯示實驗組左室收縮末期容積、心肌梗死面積均小于對照組，左室射血分數(shù)改善，兩組左室質(zhì)量、遠距未發(fā)生心肌梗死的心肌區(qū)域室壁厚度無差異性，表明CsA不僅對心肌重塑無不良作用，而且對心肌梗死面積有持續(xù)的良性作用。同樣，由于臨床實驗的約束性，該實驗樣本量偏少以至削減了其可信度，但可喜的結(jié)果值得人們進一步深入研究乃至實踐應(yīng)用。

5 關(guān)于心肌保護在動物實驗與臨床試驗的比較

許多動物實驗已經(jīng)證明CsA的心肌保護作用，而其中大部分實驗是以嚙齒動物為實驗對象，以致不能直接應(yīng)用于人類疾病。雖然已有一些小樣本臨床實驗得到了驗證，但仍缺少大規(guī)模的臨床試驗加以檢驗。同時，不得不承認有許多潛在因素可能暗示著其臨床應(yīng)用的缺陷，包括[20]:(1)動物實驗時通常使用在嚴格控制的環(huán)境下統(tǒng)一飲食標準并篩選同性別的年輕健康動物為實驗對象，而人類有著不同的種族、地域環(huán)境、遺傳特異性等變化因素。(2)人的急性心肌梗死雖是急性發(fā)病，但卻有一個漫長的病變過程，而動物實驗的心肌梗死模型心肌缺血時間明顯較短，以致于其心肌更容易獲得挽救。(3)心肌梗死患者普遍年齡較大，同時伴有諸多合并癥，而動物實驗通常以年輕、無合并癥的動物為對象。(4)實驗前，動物均未接觸過任何藥物，而患者一般均服用過藥物，這可能對缺血-再灌注損傷產(chǎn)生影響。(5)動物實驗可能不會涉及到藥物對心臟以外的其他器官的影響，而臨床實驗時藥物可能會對其他器官產(chǎn)生不良影響以致其在臨床的應(yīng)用受限。(6)在我國，CsA的臨床實驗也受到了倫理道德的制約，以致其在亞裔人種中的療效不能得到驗證與體現(xiàn)。

動物實驗的差異性和臨床實驗的限制性制約了CsA的臨床應(yīng)用，而CsA心肌保護作用的價值絕不會因此而被放棄，人們可以通過進一步的動物實驗減少物種差異性和干擾因素，并努力從小樣本開始逐步開展臨床試驗，為CsA的臨床應(yīng)用增加更多的可信度與可行性。

6 關(guān)于CsA的不良反應(yīng)

CsA的不良反應(yīng)同樣應(yīng)予以重視。作為免疫抑制劑，在移植患者中使用CsA，隨著用藥時間和劑量的積累，其不良反應(yīng)發(fā)生率逐漸升高，包括有腎毒性、多毛癥、手腳麻痹、震顫、胃腸不適、牙齦增生、可逆性肝損害等。幸運的是，在臨床試驗中[17-19]，CsA單次給藥均未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)。雖然如此，我們?nèi)圆豢珊鲆旵sA在保護心肌應(yīng)用中可能存在的負面效應(yīng)。

7 展望

CsA不僅通過與線粒體內(nèi)膜的CypD結(jié)合抑制MPTP的開放，酸性環(huán)境(pH 6.8)也可抑制MPTP的開放，抑制細胞色素C，增加Bcl-2表達，從而阻斷了后續(xù)心肌細胞的凋亡過程;另外，CsA的保護機制還可能與氯離子的外流和抑制CD4+T細胞的激活有關(guān)。許多動物實驗和一些小樣本的臨床試驗已經(jīng)驗證了CsA在缺血-再灌注時的心肌保護作用。另外，Huhn等[13]發(fā)現(xiàn)肥胖大鼠的CsA心肌保護作用受到抑制，雖然該結(jié)論有待進一步的實驗證明，但CsA在心肌梗死伴有糖尿病患者的應(yīng)用可能受到削弱甚至無效，由于心肌梗死患者常常伴發(fā)糖尿病，因此，對這方面的研究應(yīng)加以重視和深入。CsA對骨骼肌也具有缺血-再灌注損傷的保護作用，用于心臟驟停時也可改善心臟功能和生存率，CsA還能通過鈣調(diào)磷酸酶的阻滯抑制RAF1的過度表達降低肥厚型心肌病的發(fā)病率。小樣本的臨床試驗中，使用PCI作為再灌注手段時，CsA起到了保護作用，而溶栓治療則無效。物種差異性和倫理方面的限制性約束了CsA的臨床應(yīng)用。雖然動物實驗的缺陷，如動物的嚴格一致性與人類的多樣性，缺血-再灌注的短時間模擬與心肌梗死長時間的病變過程、并發(fā)癥、不良反應(yīng)和用藥史等方面諸多因素的限制，而CsA的應(yīng)用價值不會因此被放棄，進一步的研究可為其臨床應(yīng)用增加可行性。雖然CsA作為免疫抑制劑在長時間應(yīng)用具有很大的毒副作用，而在單次給藥時并未發(fā)現(xiàn)負面效應(yīng)。因此，CsA在心肌梗死患者的臨床應(yīng)用可能為臨床提供更有效的治療選擇。

[1]Arbustini E，Narula J.Cyclosporin A in reperfusion injury:not opening to cell death knocking at the door[J].Ann Thorac Surg，2010，89:1349-1351.

[2]Hausenloy DJ，Ong SB，Yellon DM.The mitochondrial permeability transition pore as a target for preconditioning and postconditioning[J].Basic Res Cardiol，2009，104:189-202.

[3]Baines CP.The molecular composition of the mitochondrial permeability transition pore[J].J Mol Cell Cardiol，2009，46:850-857.

[4]Gill RS，Bigam DL，Cheung PY.The role of cyclosporine in the treatment of myocardial reperfusion injury[J].Shock，2012，37:341-347.

[5]Murphy E，Steenbergen C.Did a classic preconditioning study provide a clue to the identity of the mitochondrial permeability transition pore[J].Circ Res，2013，113:852-855.

[6]Diaz RJ，F(xiàn)ernandes K，Lytvyn Y，et al.Enhanced cell-volume regulation in cyclosporin A cardioprotection[J].Cardiovasc Res，2013，98:411-419.

[7]Duan X，Ji B，Yu K，et al.Acidic buffer or plus cyclosporine A post-conditioning protects isolated rat hearts against ischemia-reperfusion injury[J].Perfusion，2011，26:245-252.

[8]Leshnower BG，Kanemoto S，Matsubara M，et al.Cyclosporine preserves mitochondrial morphology after myocardial ischemia/reperfusion independent of calcineurin inhibition[J].Ann Thorac Surg，2008，86:1286-1292.

[9]文兵，楊雙強.環(huán)孢霉素A對缺血再灌注心肌的保護作用與CD4+T細胞的關(guān)系[J].廣東醫(yī)學，2011，32:691-694.

[10]Xie JR，Yu LN.Cardioprotective effects of cyclosporine A in an in vivo model of myocardial ischemia and reperfusion[J].Acta Anaesthesiol Scand，2007，51:909-913.

[11]Skyschally A，Schulz R，Heusch G.Cyclosporine A at reperfusion reduces infarct size in pigs[J].Cardiovasc Drugs Ther，2010，24:85-87.

[12]Pritzwald-Stegmann P，Hoyer A，Kempfert J，et al.Cardioprotective effects of low-dose cyclosporin A added to histidine-tryptophan-ketoglutarate cardioplegia solution prior to total myocardial ischemia:an in vitro rabbit heart study[J].Pharmacology，2011，88:167-173.

[13]Huhn R，Heinen A，Hollmann MW，et al.Cyclosporine A administered during reperfusion fails to restore cardioprotection in prediabetic Zucker obese rats in vivo[J].Nutr Metab Cardiovasc Dis，2010，20:706-712.

[14]Huang CH，Tsai MS，Hsu CY，et al.Post-cardiac arrest myocardial dysfunction is improved with cyclosporine treatment at onset of resuscitation but not in the reperfusion phase[J].Resuscitation，2011，82:S41-S47.

[15]Dhandapany PS，F(xiàn)abris F，Tonk R，et al.Cyclosporine attenuates cardiomyocyte hypertrophy induced by RAF1 mutants in Noonan and LEOPARD syndromes[J].J Mol Cell Cardiol，2011，51:4-15.

[16]Troitzsch D，Moosdorf R，Hasenkam JM，et al.Effects of cyclosporine pretreatment on tissue oxygen levels and cytochrome oxidase in skeletal muscle ischemia and reperfusion[J].Shock，2013，39(2):220-226.

[17]Piot C，Croisille P，Staat P，et al.Effect of cyclosporine on reperfusion injury in acute myocardial infarction[J].N Engl J Med，2008，359:473-481.

[18]Ghaffari S，Kazemi B，Toluey M，et al.The effect of prethrombolytic cyclosporine-A injection on clinical outcome of acute anterior ST-elevation myocardial infarction[J].Cardiovasc Ther，2013，31:e34-e39.

[19]Mewton N，Croisille P，Gahide G，et al.Effect of cyclosporine on left ventricular remodeling after reperfused myocardial infarction[J].J Am Coll Cardiol，2010，55:1200-1205.

[20]vander Heide RS，Steenbergen C.Cardioprotection and myocardial reperfusion:pitfalls to clinical application[J].Circ Res，2013，113:464-477.