岳萬松，熊 勇，2，陳毅堅，2，*

（1.云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650500;2.國家民委—教育部共建民族藥資源化學(xué)重點實驗室，云南昆明 650500）

牛肝菌科（Boletaceae）是擔(dān)子菌亞門傘菌目的重要一科。云南是野生食用菌的王國，目前已知牛肝菌有224種，食用菌144種，分別占全國總數(shù)的62%和72%。牛肝菌含有多糖、生物堿、甾醇類化合物、酸類化合物等活性物質(zhì)，可用于治療腰腿疼痛、手足麻木、四肢抽搐等疾病，還具有抗流感病毒、防治感冒的作用［1］。在云南產(chǎn)量多、味道鮮美、又具經(jīng)濟(jì)價值的有4種:小美牛肝菌（地方名見手青）［Boletus speciosus Frost］、銅色牛肝菌（地方名黑牛肝）［Boletus aereus］、黃皮疣柄牛肝菌（地方名黃牛肝、黃癩頭）［Leccinum crocipodium］、美味牛肝菌（地方名白牛肝）［Boletus edulis］［2］。至今，牛肝菌除個別種據(jù)報道在實驗室條件下栽培成功［3－6］，絕大多數(shù)種類尚不能通過人工栽培形成子實體［7－8］。目前有關(guān)野生食用牛肝菌的研究主要集中在其營養(yǎng)成分分析［9－10］和化學(xué)成分分析［11－12］，此外，多篇文獻(xiàn)［13－15］對牛肝菌活性物質(zhì)多糖的免疫、抗腫瘤及抗氧化作用進(jìn)行了研究分析。

內(nèi)生真菌定殖于健康的生物組織內(nèi)，種類繁多，分布廣泛［16］。近年來，內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物的研究倍受關(guān)注，大量具有抗菌、抗癌、殺蟲等活性的次生代謝產(chǎn)物從內(nèi)生真菌中分離出來［17－19］，內(nèi)生真菌已經(jīng)成為開發(fā)活性物質(zhì)資源庫。目前國內(nèi)外對大型真菌的內(nèi)生真菌方面的研究甚少，仍需進(jìn)一步研究。本文以產(chǎn)自云南的牛肝菌不同種為材料，分離、純化其內(nèi)生真菌并進(jìn)行形態(tài)特征研究，再結(jié)合rDNA ITS序列分析進(jìn)行分子鑒定，確定內(nèi)生菌株的種屬歸類，旨在為牛肝菌內(nèi)生真菌資源的開發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛肝菌 實驗用新鮮牛肝菌子實體小美牛肝菌（地方名見手青）、銅色牛肝菌（地方名黑牛肝）、黃皮疣柄牛肝菌（地方名黃牛肝、黃癩頭）、美味牛肝菌（地方名白牛肝），均于2013年8～9月分別購自云南省玉溪市和曲靖市集貿(mào)市場，新鮮子實體用保鮮袋包裝帶回實驗室，24h內(nèi)完成內(nèi)生真菌的分離;引物ITS4、ITS5和 DNA MarKer 北京博邁德生物;2×Power Taq PCR MasterMix 北京百泰克;分離培養(yǎng)基 配制根據(jù)參考文獻(xiàn)［20］完成;固體培養(yǎng)基Ⅱ KH2PO40.5g，MgSO40.25g，酒石酸銨 1g，麥芽糖 0.25g，維生素B1 0.5mL（40μg/L），葡萄糖 10g，瓊脂粉 10g，蒸餾水500mL（pH6.0），121℃，滅菌 20min 后備用;液體培養(yǎng)基Ⅱ 配方同上，勿加瓊脂粉。

Eppedorf 5331 PCR儀 德國;GENE GENIUS凝膠成像系統(tǒng) 美國;DYY－GB電泳儀、DYCP－31DN電泳槽 北京六一。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛肝菌內(nèi)生真菌的分離純化培養(yǎng) 取新鮮的牛肝菌子實體，自來水沖洗數(shù)次，去除表面雜質(zhì)，無菌水沖洗3遍，75%乙醇漂洗3min，再用無菌水沖洗3～5次。用無菌解剖刀將牛肝菌子實體的表皮去掉，將內(nèi)部的組織切割成0.5cm左右的小塊，接種于培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)5～7d。待組織小塊周圍有內(nèi)生真菌長出后，挑取少許菌絲培養(yǎng)物，純化培養(yǎng)后，部分轉(zhuǎn)接至固體培養(yǎng)基Ⅱ斜面上保存?zhèn)溆?另一部分轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基Ⅱ里（培養(yǎng)條件為:150r/min，28℃恒溫培養(yǎng)3～4d），每12h觀察菌種生長情況，最后用無菌濾紙過濾得到菌絲體，存于－70℃冰箱里待用。

1.2.2 牛肝菌內(nèi)生真菌菌落特征和顯微特征觀察 將分離純化得到的牛肝菌內(nèi)生真菌菌株于培養(yǎng)基Ⅱ平板上三點種植和插片培養(yǎng)5～7d，菌落長出后用于觀察，插片置于顯微鏡下觀察顯微形態(tài)特征，對菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.2.3 牛肝菌內(nèi)生真菌分子鑒定

1.2.3.1 DNA提取 將分離的牛肝菌內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)獲得的菌絲體用于提取DNA，總DNA提取方法參照 CTAB－SDS 法［21－22］并加以改良，用瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品DNA質(zhì)量。

1.2.3.2 PCR 擴(kuò) 增、測 序 ITS 通 用 引 物 （ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC;ITS5:GGAAGTAAAA GTCGTA－ACAAGG）［23］，50μL 反應(yīng)體系包括:25μL 2 ×Power Taq PCR Mixture，引物各2μL，5μL DNA 模板，16μL ddH2O;反應(yīng)條件:預(yù)變性 94℃ 5min，94℃30s，52℃ 30s，72℃ 30s，35 次循環(huán)，72℃ 10min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，采用Bio－Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.3.3 PCR 產(chǎn)物的純化、測序及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建PCR產(chǎn)物用多功能DNA純化回收試劑盒回收，送昆明碩陽科技有限公司測序。測序結(jié)果DNAMAN進(jìn)行拼接，MEGA 5.13分析相關(guān)數(shù)據(jù)，構(gòu)建發(fā)育樹，同時將得到的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，并通過在線Blast工具從NCBI下載GenBank等數(shù)據(jù)庫內(nèi)已知同源序列多條作為參考序列，用 MEGA 5.13中的Kimura－2－parameter（K2P）模型，鄰接（neighborjoining method，N－J）法構(gòu)建聚類圖。并應(yīng)用 DNA STAR和RNAVIZ2.0預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛肝菌內(nèi)生真菌的形態(tài)特征

從4種新鮮牛肝菌子實體內(nèi)部組織塊中分離培養(yǎng)獲得5株內(nèi)生真菌純菌株，編號為YX1－6、YX1－7、QJ3－6、QJ3－7、QJ3－8，5 株內(nèi)生真菌的菌落特征和顯微特征見圖1，特征描述記錄和初步鑒定結(jié)果見表1（鑒定結(jié)果參考中國科學(xué)院微生物研究所編寫的《常見與常用真菌》完成［24］）

圖1 牛肝菌內(nèi)生真菌 YX1－6、YX1－7、QJ3－6、QJ3－7、QJ3－8在培養(yǎng)基Ⅱ上的生長特征Fig.1 Morphology and hyphal structure of YX1－6，YX1－7，QJ3－6，QJ3－7 and QJ3－8 isolated from boletus

2.2 不同牛肝菌內(nèi)生真菌菌株ITS序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

分離獲得的牛肝菌5株內(nèi)生真菌的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

從圖2可見，5株菌序列長度約在430～630bp之間，PCR產(chǎn)物均出現(xiàn)比Marker清晰明顯的條帶，說明實驗所提的DNA質(zhì)量較好。

2.3 牛肝菌內(nèi)生真菌rDNA ITS序列NJ樹構(gòu)建及分析

分離到的內(nèi)生真菌分成5組:YX1－6、YX1－7、QJ3－6、QJ3－7和 QJ3－8 分別各為 1 組，做序列相似性比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹以NCBI中的ITS序列為聚類外群，采用N－J法對不同牛肝菌內(nèi)生真菌進(jìn)行分析并構(gòu)建遺傳關(guān)系樹，自舉檢測1000次。所構(gòu)建的系統(tǒng)樹見（圖3）。

表1 牛肝菌內(nèi)生真菌特征記錄和初步鑒定結(jié)果Table 1 The preliminary identification results endophytic fungi from boletus

圖2 5株牛肝菌內(nèi)生真菌菌株ITS－PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Amplification profile of electrophoretogram ITS－PCR of 5 strains of boletus endophyte

通過在線BLAST工具從NCBI數(shù)據(jù)庫內(nèi)下載已知的多條相似序列作為參考序列，比較它們的相似性，并用 MEGA 5.13 中的 Kimura－2－parameter（K2P）模型，鄰接（neighbor－joining method，N－J）法構(gòu)建發(fā)育樹（見圖3），NJ發(fā)育樹分析結(jié)果表明:YX1－6與NCBI數(shù)據(jù)庫里的多株Trametes hirsuta形成自檢支持率為99%的一個分支，它們親緣關(guān)系較近，且BLAST比對結(jié)果顯示:YX1－6與Trametes hirsuta相似性都很高，為99%，鑒定為毛栓菌（Trametes hirsuta）。NJ發(fā)育樹分析結(jié)果表明:YX1－7與NCBI庫里的多株Chaetomium aureum形成自檢支持率為99%的一個大分支，二者親緣關(guān)系很近，且BLAST比對結(jié)果顯示:YX1－7與多株Chaetomium aureum相似性較高，為99%，鑒定為金色毛殼菌（Chaetomium aureum）。NJ發(fā)育樹分析結(jié)果表明:QJ3－6菌株與Candida sp（DQ104728）、Candida sp（KF057545）、Candida sp（KF057544）等假絲酵母屬菌株形成自檢支持率為100%的一個分支，它們的親緣關(guān)系較近，且BLAST比對結(jié)果顯示:QJ3－6菌株與多株Candida sp相似性高達(dá)99%，鑒定為假絲酵母屬真菌（Candida sp）。NJ發(fā)育樹分析結(jié)果表明:QJ3－7菌株與多株Mortierella sp形成自檢支持率為100%的一個分支，親緣關(guān)系較近，且 BLAST比對結(jié)果顯示:QJ3－7菌株與Mortierella sp（KC180749）相似性高達(dá)100%，鑒定為被孢霉屬菌株。NJ發(fā)育樹分析結(jié)果表明:菌株QJ3－8與Eurotium amstelodami多株菌株形成自檢支持率為96%的一個分支，親緣關(guān)系較近，且BLAST比對結(jié)果顯示:QJ3－8與Eurotium amstelodami（AF455470）、Eurotium amstelodami（HQ728257）和Eurotium rubrum（AF455528）等多株散囊菌屬菌株的的相似性都高達(dá)100%，鑒定為散囊屬真菌。

2.4 牛肝菌內(nèi)生真菌及其NCBI數(shù)據(jù)庫相似種ITS rRNA二級結(jié)構(gòu)比較

利用DNA STAR和RNAVIZ2.0預(yù)測并比較牛肝菌內(nèi)生真菌及其NCBI數(shù)據(jù)庫相似種的二級結(jié)構(gòu)，牛肝菌內(nèi)生真菌及其NCBI數(shù)據(jù)庫相似種編號分別為YX1－6和Trametes hirsuta（JN048768、YX1－7和Chaetomium aureum（HQ607894）、QJ3－6 和Candidasp（DQ104728）、Mortierellasp（FJ810149）、Eurotium amstelodami（HQ728257），5株牛肝菌內(nèi)生真菌及其NCBI數(shù)據(jù)庫相似種ITS rRNA二級結(jié)構(gòu)異同點見表2。

圖3 根據(jù)rDNA ITS基因序列構(gòu)建的牛肝菌內(nèi)生真菌與參考類群間的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of boletus endophyte based on rDNA ITS and reference taxa

表2 牛肝菌內(nèi)生真菌及其NCBI數(shù)據(jù)庫相似種ITS rRNA二級結(jié)構(gòu)比較Table 2 Contrast and analysis of ITS ribosomal RNA secondary structure ofboletus endophyte and their similar species in NCBI database

3 結(jié)論和討論

本文的實驗研究，從云南牛肝菌4個種的新鮮子實體中分得5株內(nèi)生真菌，用經(jīng)典分類方法和分子生物學(xué)方法鑒定為:YX1－6為毛栓菌（Trametes hirsuta），YX1－7為金色毛殼菌（Chaetomium aureum），QJ3－6 為假絲酵母屬真菌（Candidasp.），QJ3－7 為被孢霉屬真菌（Mortierellasp.），QJ3－8 為散囊菌屬真菌（Eurotiumsp.），從分類結(jié)果可見不同種的牛肝菌的內(nèi)生真菌也不同，顯示了內(nèi)生真菌的多樣性特征。

進(jìn)一步用DNA STAR和RNAVIZ2.0分析軟件預(yù)測了它們的二級結(jié)構(gòu)，用于分析研究其分類地位。分析結(jié)果顯示各分離菌株及其相似種的ITS序列二級結(jié)構(gòu)均為一個中心環(huán)及多個螺旋區(qū)構(gòu)成，每個螺旋上又有或多或少的大小不一的莖、環(huán)結(jié)構(gòu)，說明牛肝菌內(nèi)生真菌既具有結(jié)構(gòu)上的共性，又具有鮮明的個性差異。

真菌種類繁多，形態(tài)復(fù)雜，因此需要采用形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理生化等表型方面的特征和各種分子生物學(xué)手段進(jìn)行分類鑒定。該論文對牛肝菌內(nèi)生真菌的分類鑒定，在形態(tài)結(jié)構(gòu)和分子水平上都進(jìn)行了研究，所得結(jié)果一致并可相互印證，可見對內(nèi)生真菌分類研究，采用綜合性手段的必要性和可靠性。

［1］黃自來.中國食用菌百科［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1993:56－59.

［2］王海坤，李濤，趙丹丹，等.兩株滇產(chǎn)廣義美味牛肝菌的分離培養(yǎng)及其分子鑒定［J］.云南植物研究，2007，29（5）:559－562.

［3］ McLaughlin DJ.Environmentalcontroloffruitbody development in Boletus rubellus in axenic culture［J］.Mycologia，1970，62:307－331.

［4］Pantidou M，Watling R.Fruit－bodies of Boletus amarellus in pure－culture［J］.Notes from the Royal Botanic Garden，1973，32:439－443.

［5］Yamanaka K，Namba K，Tajiri A.Fruit body formation of Boletus reticulatus in pure culture［J］.Mycoscience，2000，41:189－191.

［6］Ohta A，F(xiàn)ujiwara N.Fruit－ body production ofan ectomycorrhizal fungus in genus Boletus in pure culture［J］.Mycoscience，2003，44:295－300.

［7］黃年來.中國大型真菌原色圖譜［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

［8］吳曉剛.牛肝菌的分離培養(yǎng)及磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆［D］.昆明:云南大學(xué)，2012.

［9］朱萍，郭永紅，丁曉雯，等.四種鮮牛肝菌成分分析［J］.中國食用菌，2006，25（4）:44－45.

［10］冮潔，李學(xué)偉，金懷剛.美味牛肝菌菌絲體與子實體蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的評價［J］.食品科學(xué)，2013，34（3）:253－255.

［11］沈杰.遠(yuǎn)東疣柄牛肝菌的化學(xué)成分［D］.楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué)，2003.

［12］劉佳，殷忠，高敏，等.野生牛肝菌化學(xué)成分分析及遺傳毒性研究［J］.微量元素與健康研究，2007，24（3），3－4.

［13］李志洲.美味牛肝菌多糖的抗氧化性［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（4），49－51.

［14］李娜.泰山美味牛肝菌多糖提取純化及功能研究［D］.泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［15］唐薇，魯新成.美味牛肝菌多糖的生物活性及其抗S－180腫瘤的效應(yīng)［J］.西南師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，1999，24（4）:478－481.

［16］Petrini O.Fungal endophytes of tree leaves［C］//Andrews J H，Hirano S S eds.Microbial ecology of leaves.New York:Springer－Verlag，1991:179－197.

［17］Strobel G，Stierle A，Stierle D.Taxomyces andreanae:a proposed new taxon for a bulbilliferous by phomycete associated with pacific yew（Taxus brevifolia）［J］.Mycotaxon，1993，38（3）:214.

［18］黃忠京，楊瑞云，白麗娟，等.南海紅樹林內(nèi)生真菌ZSUH26生物堿類代謝產(chǎn)物的研究［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2009，21（11）:1566－1570.

［19］Harper J K，F(xiàn)ord E J，Strobel G A，et al.Pestacin:a 1，3－dihydro isobenzofuran from Pestalotiopsis microspora possessing antioxidant and antimycotic activities［J］.Tetrahedron，2003，59:2471－2476.

［20］劉瓊波，蘇開美，白永順，等.美味牛肝菌的菌種分離培養(yǎng)實驗初探［J］.食用菌，2007（4）:25－26.

［21］曾大興.適于RAPD分析的真菌DNA提取方法［J］.生物技術(shù)，2003，13（2）:2.

［22］江樹勛，邵碧英，陳文炳，等.15種常見食（藥）用菌的3種總DNA提取方法比較研究［J］.食品科學(xué)，2004，25（5）:37.

［23］WhiteTJ，Bruns TD，Lee SB，et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics［A］.In:Innis MA，Gelfand DH，SninskyJJ eds，PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications［M］.NewYorks:Academic Press，1990:315－321.

［24］中國科學(xué)院微生物研究所《常見與常用真菌》編寫組.常見與常用真菌［M］.北京:科學(xué)出版社，1978.