薛海燕，杜枘宣，韓 芳，宋宏新

（1.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安 710021;2.陜西恒通果汁集團(tuán)股份有限公司，陜西西安 710075）

卵黃抗體（IgY）是特定病原菌免疫禽類后，由母雞血清中的免疫球蛋白選擇性地轉(zhuǎn)移到卵黃，是存在于卵黃中的一種免疫球蛋白［1］。IgY是一種高產(chǎn)量、安全、高療效的生物醫(yī)藥制品，口服IgY，無致癌、無毒、無過敏反應(yīng)、致突變、致畸，且不結(jié)合補(bǔ)體和Fc受體［2］。已有針對毒素、細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等IgY 的研究報(bào)道，如牙周致病菌［3］、幽門螺桿菌［4］、輪狀病毒［5］、大腸桿菌［6］、白色念珠菌［7］、血吸蟲［8］等。然而IgY用于胃腸道疾病防治時(shí)，由于IgY容易受到胃部環(huán)境的影響，而被酸和酶降解，導(dǎo)致治療效果顯著降低［9－10］。王麗英等［11］通過單甲氧基聚乙二醇（mPEG）對IgY進(jìn)行了化學(xué)修飾，提高了它的酸堿穩(wěn)定性。Kovacs－Nolan J［10］利用甲基丙烯酸共聚物包埋 IgY，Li xiao－yu 等人［12］利用殼聚糖與海藻酸鈉制備IgY微囊，均顯示了良好的活性保護(hù)作用。殼聚糖，α（1，4）－2－氨基－2－脫氧 β－D－葡聚糖，是一種無毒，低免疫原性，可生物降解的聚陽離子聚合物，具有pH響應(yīng)性，是一種新型生物醫(yī)學(xué)和藥物傳遞應(yīng)用材料［13］。以殼聚糖為壁材制成的微囊，能夠保護(hù)IgY在胃中不被酸和酶降解，而是安全到達(dá)小腸，最大限度地發(fā)揮免疫治療作用。

本研究采用無溶劑法制備一種IgY/殼聚糖微囊。以殼聚糖為壁材，三聚磷酸鈉（TPP）為交聯(lián)劑，離子交聯(lián)法在溫和水相中制備IgY－殼聚糖微囊，通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝。并通過納米粒度及Zeta電位分析儀和掃描電鏡對IgY/殼聚糖微囊進(jìn)行表征，為IgY免疫防治功能開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

EHEC O157∶H7（EDL 933） 由中國疾病預(yù)防控制中心饋贈(zèng);免疫用雞為3個(gè)月臨產(chǎn)蛋母雞 購自西安郊區(qū)雞場;完全弗氏佐劑與不完全弗氏佐劑 美國Sigma公司;標(biāo)準(zhǔn)雞IgG及HRP酶標(biāo)兔抗雞Ig G 北京博奧森生物技術(shù)有限公司;殼聚糖（分析純，脫乙酰度為92.39%，粘均分子量為600kDa） 日本BETTER公司;三聚磷酸鈉（TPP，分析純） 天津市天力化學(xué)試劑有限公司;牛血清白蛋白（BSA，分析純） 北京鼎國生物技術(shù)有限公司;其他化學(xué)試劑均為分析純級。

磁力加熱攪拌器 國華電器有限公司;HC－3018R型高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳儀器有限公司;酶標(biāo)儀（Wellscan－MK－3）Thermo公司;超濾系統(tǒng)（超濾膜截留分子量5萬）Millipore公司;精密 pH 計(jì) Sartorius;Christ Alpha 1－4/2－4 LD plus型冷凍干燥機(jī) 德國Marin Christ公司;UV－2600型紫外－可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司;馬爾文納米粒度及Zeta電位分析儀ZS90 英國馬爾文儀器有限公司;S－2700型掃描電鏡 日本日立集團(tuán)。

1.2 IgY/殼聚糖微囊的制備與表征

1.2.1 卵黃抗體的制備 抗大腸桿菌－IgY的制備方法參考文獻(xiàn)［14］進(jìn)行。即以煮沸法滅活E.coliO157∶H7制備菌體抗原，與等量完全弗氏佐劑混合后，免疫3只臨產(chǎn)母雞，每只雞2mL，胸肌兩點(diǎn)及翅下兩點(diǎn)注射。每間隔兩周采用不完全弗氏佐劑與抗原等量混合加強(qiáng)免疫，共加強(qiáng)免疫3次。首免后開始收集雞蛋，間接ELISA檢測IgY效價(jià)［14］，收集效價(jià)達(dá)1∶4000以上的卵黃制備IgY，蛋白質(zhì)含量采用280紫外比色法檢測。分離純化方法參考文獻(xiàn)［15］，采用水稀釋－凍融法獲得水溶性組分（WSF），50kDa超濾膜超濾濃縮5倍后，45%的飽和硫酸銨鹽析沉淀IgY，離心后獲得的沉淀對0.02mol/L PBS透析除鹽，用于后續(xù)研究。鹽析IgY經(jīng)間接ELISA檢測效價(jià)為1∶40000，蛋白質(zhì)含量 24.6mg/mL。

1.2.2 IgY/殼聚糖微囊的制備 將一定量殼聚糖溶于1%乙酸溶液，加入適當(dāng)濃度IgY后用1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至5.6，在高速磁力攪拌下，緩慢滴入TPP溶液，待觀察到體系呈現(xiàn)乳光時(shí)，停止攪拌，將混懸液高速離心（10000×g，4℃，45min），用紫外分光光度法測定上清液中IgY的蛋白質(zhì)濃度。離心得到的沉淀，即微囊，冷凍干燥，稱量。按照下式分別計(jì)算微囊對IgY的包封率和載藥量。間接ELISA檢測反應(yīng)后及溶出后IgY活性，計(jì)算活性保留率。

1.2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法優(yōu)化IgY/殼聚糖微囊制備工藝 根據(jù)已有研究文獻(xiàn)的初步實(shí)驗(yàn)研究［16－17］，確定殼聚糖溶液的質(zhì)量濃度、殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比、IgY的質(zhì)量濃度作為影響IgY－殼聚糖微囊包封率和載藥量的主要因素，以殼聚糖溶液的質(zhì)量濃度（X1）、殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比（X2）、IgY的質(zhì)量濃度（X3）作為考察對象，以殼聚糖微囊對IgY的包封率（Y1）和載藥量（Y2）為響應(yīng)值，采用Design－Expert 8.0.5統(tǒng)計(jì)分析軟件的效應(yīng)面法安排實(shí)驗(yàn)，星點(diǎn)設(shè)計(jì)的因素及水平見表1。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)的因素與水平Table 1 Factors and levels in the central composite design

1.2.4 IgY/殼聚糖微囊的表征 10mL以最佳方法制備的IgY－殼聚糖微囊混懸液，pH調(diào)至6.5，經(jīng)超聲分散6min后，通過馬爾文納米粒度儀及Zeta電位分析儀表征其平均粒徑、分散度及表面電位［18］。微囊混懸液于光學(xué)顯微鏡下觀察外觀，經(jīng)24h冷凍干燥后的IgY微囊真空噴金后，采用掃描電鏡（SEM）觀察其表面形態(tài)。

1.3 IgY/殼聚糖微囊的體外釋放性能

精確稱取100mg經(jīng)冷凍干燥的IgY－殼聚糖微囊及25mg凍干IgY，以模擬胃液（SGF）及磷酸鹽緩沖液20mL為溶出介質(zhì)，于37℃，100r/min進(jìn)行釋放度實(shí)驗(yàn)。分別于 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0h 各取樣2mL，同時(shí)補(bǔ)足同體積等溫溶出液，樣品液過濾后測定IgY蛋白質(zhì)濃度，間接ELISA法測定樣品的吸光度值OD450，計(jì)算活性保留率及累積釋放率，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。以時(shí)間為橫軸、累積釋放率為縱軸繪制釋放曲線［19］。

2 結(jié)果與分析

2.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法優(yōu)化IgY/殼聚糖微囊的制備工藝

2.1.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化微囊制備條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Central composite design arrangement and experimental results

采用Design－Expert 8.0.5統(tǒng)計(jì)分析軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合回歸，得到效應(yīng)面的回歸方程:

殼聚糖微囊對IgY的包封率（Y1）和載藥量（Y2）的數(shù)學(xué)擬合模型的相關(guān)系數(shù)分別為0.7960和0.7334，說明通過多元二次回歸得到的Y1和Y2的模型與實(shí)驗(yàn)擬合較好，具有較高的可靠性。當(dāng)p值小于0.05時(shí)，即表示該項(xiàng)指標(biāo)顯著。根據(jù)Y1和Y2模型的方差分析結(jié)果（表3），推測出殼聚糖微囊對IgY的包封率和載藥量建立的回歸數(shù)學(xué)模型顯著（p＜0.05）。

模型的方差分析（表3）結(jié)果表明，殼聚糖微囊對IgY的包封率（Y1）和載藥量（Y2）模型，根據(jù)3個(gè)因素的F值大小可以推斷，在所選擇的實(shí)驗(yàn)條件下，3個(gè)因素影響Y1和Y2的主效應(yīng)順序均為:殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比（X2）＞IgY的質(zhì)量濃度（X3）＞殼聚糖溶液的質(zhì)量濃度（X1）。

2.1.2 效應(yīng)面分析 根據(jù)回歸方程，應(yīng)用Design－Expert 8.0.5軟件分別繪制Y1和Y2與自變量的效應(yīng)面圖（其他2個(gè)自變量設(shè)為中心點(diǎn)值），結(jié)果見圖1。圖1A表明，在殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比較小和IgY的質(zhì)量濃度適中時(shí)，微囊的包封率較高。在所選范圍內(nèi)，微囊的包封率存在最大值。圖1B表明，在殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比較小和IgY的質(zhì)量濃度較高時(shí)，微囊的載藥量較高，在所選操作范圍內(nèi)，微囊的載藥量存在最大值。

表3 殼聚糖微囊對IgY的包封率和載藥量的模型方差分析Table 3 ANOVA for the entrapment efficiency and the loading efficiency for IgY of chitosan microencapsulation

圖1 殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比和IgY的質(zhì)量濃度對包封率Y1（A）及載藥量Y2（B）影響的效應(yīng)面圖Fig.1 Three－dimensional response surface diagram（B）showing the chitosan/TPP（w/w）and IgY（mg/mL）on Y1and Y2

應(yīng)用Design－Expert 8.0.5軟件優(yōu)化程序，得出制備IgY－殼聚糖微囊的最佳制備工藝參數(shù):殼聚糖溶液的質(zhì)量濃度0.23g/100mL，殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比3.93∶1，IgY的質(zhì)量濃度2.46mg/mL。在此制備工藝條件下，殼聚糖微囊對IgY的包封率和載藥量的預(yù)測值較高，分別可以達(dá)到95.79%和27.84%。

考慮實(shí)際操作便利，最佳工藝修正為殼聚糖溶液的質(zhì)量濃度0.23g/100mL，殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比4∶1（預(yù)測為3.93∶1），IgY 的質(zhì)量濃度 2.46mg/mL，制備IgY－殼聚糖微囊。測定微囊的包封率和載藥量，以驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性。結(jié)果顯示包封率的實(shí)測值93.26%，載藥量的實(shí)測值25.64%。實(shí)測值與未調(diào)整的預(yù)測值偏差較小，說明所得到的優(yōu)化區(qū)域符合設(shè)計(jì)目標(biāo)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)模型具有可靠性和重現(xiàn)性?？梢娦?yīng)面法得到的制備條件較為可靠，具有使用價(jià)值。采用ELISA檢測微囊制備后上清中游離IgY及在PBS中釋放8h的IgY的活性保留率，分別為96.3%和94.0%，表明在制備過程中IgY活性受到影響較小。

2.2 IgY/殼聚糖微囊的表征

采用納米粒度及Zeta電位分析儀檢測在最佳條件下制備的IgY/殼聚糖微囊懸浮液，如圖2A，測得微囊平均粒徑為2.16μm，PDI為0.312，小于0.5，說明微囊分散均勻。測得空白微囊的Zeta電位為37.86mV，IgY/殼聚糖微囊的 Zeta電位為26.20mV（如圖2B），表面電位明顯降低，IgY在大于等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，隨著IgY通過離子作用與殼聚糖微囊結(jié)合，使微囊表面電荷趨于中性化，即表現(xiàn)為Zeta電位降低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IgY－殼聚糖微囊的表面與IgY結(jié)合。

圖2 IgY－殼聚糖微囊的粒徑及Zeta電位分布圖Fig.2 Particle size and Zeta potential distribution of IgY－chitosan microencapsulation

采用優(yōu)化后的方法制得IgY/殼聚糖微囊顯微照片如圖3A所示，分散性較好。IgY/殼聚糖微囊經(jīng)冷凍干燥后進(jìn)行SEM，如圖3B，微囊出現(xiàn)大量聚集，但依稀可看到大量氣孔。這是由于殼聚糖的分子鏈上含有大量的游離氨基，易與三聚磷酸鈉發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，冷凍干燥后水分子升華，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［19－20］。而且由于IgY帶有負(fù)電荷，冷凍干燥后，離子周圍水化層消失，還會導(dǎo)致微囊聚集度增加。

圖3 IgY/殼聚糖微囊的顯微照片及SEM圖Fig.3 Scanning electron microscopy（SEM）of IgY－chitosan microencapsulation

2.3 IgY/殼聚糖微囊的體外釋放性能

IgY/殼聚糖微囊的持續(xù)釋放性能如圖4所示。IgY/殼聚糖微囊在SGF中，30min的累積釋放率只有12.2%，在1h時(shí)累積釋放率達(dá)到61.3%，在2h及以后時(shí)達(dá)到85%以上。在PBS緩沖液中，在30min時(shí)累積釋放率只有6.1%，在1h時(shí)只有22.6%，在2h時(shí)達(dá)到54.6%，在4h時(shí)達(dá)到86.0%。凍干IgY在30min內(nèi)，在SGF和PBS中基本完全釋放，而且在SGF中，15min后IgY由于分解所測得的含量還有所下降，因此經(jīng)微囊化后對IgY釋放具有明顯的緩釋作用，而且避免了胃液的分解帶來的活性損失。同時(shí)檢測SGF溶液中IgY的含量，計(jì)算活性保留率。對未經(jīng)包埋的IgY，其活性保留率在1.5h時(shí)迅速降至10.4%，而IgY/殼聚糖微囊在SGF中釋放1.5h時(shí)，其活性保留率為 85.2%，釋放 6h后，其活性保留率仍然在79.5%。

圖4 IgY/殼聚糖微囊的體外釋放曲線Fig.4 Release curve in vitro of IgY/chitosan microencapsulation

Li Xiaoyu等［12］將IgY經(jīng)過殼聚糖－海藻酸鈉包埋后，載藥量為25%（w/w），包封率73.93%，經(jīng)胃腸平均活性保留率在40%～70%之間，SGF中釋放2h的活性保留率最高為74%。本研究采用單一殼聚糖制備微囊，通過響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝后，載藥量也達(dá)到25%以上，而包封率達(dá)到93%，IgY活性保留維持在80%以上，有效地提高了IgY的制備利用效率和生物利用效率。制備操作方法簡單可行，不影響活性。

3 結(jié)論

本研究通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法確定了IgY/殼聚糖微囊最佳制備工藝條件為，殼聚糖溶液的質(zhì)量濃度0.23g/100mL、殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比4∶1，IgY 的質(zhì)量濃度 2.46mg/mL，制得微囊的包封率為93.26%，載藥量為25.64%。微囊平均粒徑為2.16μm，Zeta電位為26.20mV，顯微照片顯示微囊的分散度較好。該微囊在模擬胃液及PBS中均具有較好的緩釋性能，且通過微囊化能保護(hù)IgY，減少活性損失。進(jìn)一步還應(yīng)探討如何提高載藥量的問題，本研究為胃腸給予IgY的研究開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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