戚志超，朱小兵，劉志群，吳論，常龍海

(中山市中醫(yī)院麻醉科，廣東中山528411)

·論著·

烏司他丁對(duì)大鼠呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷的影響

戚志超，朱小兵，劉志群，吳論，常龍海

(中山市中醫(yī)院麻醉科，廣東中山528411)

目的評(píng)價(jià)烏司他丁對(duì)大鼠呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷(VILI)的影響及機(jī)制。方法36只成年雄性SD大鼠，體重300～350 g，隨機(jī)分為三組(n=12)：對(duì)照組(C組)、機(jī)械通氣組(V組)和烏司他丁組(U組)。采用大潮氣量(VT=40 ml/kg)機(jī)械通氣2.5 h制備大鼠VILI模型。U組實(shí)驗(yàn)前30 min腹腔注射烏司他丁10 000 U/100 g，V組和C組給予等容量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)抽取3 ml動(dòng)脈血離心取上清液，置于-80℃冰箱凍存待測(cè)。然后處死大鼠，取肺組織，測(cè)定肺組織濕/干重(W/D)比，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)結(jié)果；收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)并測(cè)定其中的蛋白含量、白細(xì)胞計(jì)數(shù)以及采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定血清和BALF中腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素8(IL-8)的水平。計(jì)算肺的通透指數(shù)(LPI)。結(jié)果與C組比較，V組血清TNF-α、IL-8濃度，肺組織TNF-α、IL-8含量、W/D比、LPI、白細(xì)胞顯著升高(P＜0.05)；與V組比較，U組血清TNF-α、IL-8濃度，肺組織TNF-α、IL-8含量、W/D比、LPI、白細(xì)胞顯著減少(P＜0.05)。U組肺組織病理學(xué)損傷較V組減輕。結(jié)論烏司他丁可減輕VILI，其機(jī)制與抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。

烏司他丁；肺損傷；呼吸窘迫綜合征；成人；炎性細(xì)胞因子

呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷(Ventilator induced lung injury，VILI)是由機(jī)械通氣引起的嚴(yán)重肺部并發(fā)癥，探索減輕VILI的有效措施，具有重要的臨床意義。近年來(lái)的研究證明，VILI不僅是一種機(jī)械性的損傷，還是一種生物傷；肺內(nèi)異常激活和放大的炎癥反應(yīng)，即生物傷才是VILI的基礎(chǔ)[1-2]。烏司他丁(Ulinastatin)是一種廣譜蛋白酶抑制劑，能抑制多種蛋白、糖和脂類(lèi)水解酶的活性，減少炎性介質(zhì)的過(guò)度釋放，改善微循環(huán)和組織灌注[3]，但其對(duì)呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷的影響有待于進(jìn)一步研究。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)擬評(píng)價(jià)烏司他丁對(duì)大鼠VILI的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物選擇及分組成年雄性SD大鼠36只(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重300～350 g，隨機(jī)分為三組(n=12)：對(duì)照組(C組)，不行機(jī)械通氣；機(jī)械通氣組(V組)；烏司他丁組(U組)。U組于實(shí)驗(yàn)前30 min給予腹腔注射烏司他丁1萬(wàn)U/100 g(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司批號(hào)：031012052)，V組和C組給予等容量生理鹽水。

1.2 VILI模型的制備根據(jù)何海軍等[4]的實(shí)驗(yàn)方法，制備大鼠VILI模型。20%烏拉坦溶液(1.4 g/kg)腹腔注射麻醉，22#動(dòng)脈穿刺針行股動(dòng)脈和股靜脈穿刺置管，股動(dòng)脈連接8500Q小動(dòng)物生理監(jiān)測(cè)儀(CSl公司，美國(guó))；靜脈輸注乳酸鈉林格氏液10 ml·kg-1·h-1；完成氣管切開(kāi)并置入氣管導(dǎo)管，機(jī)械通氣2.5 h。呼吸參數(shù)設(shè)置：潮氣量(VT)=40 ml/kg，呼吸頻率(RR)= 40次/min，吸呼比(I:E)=1:1，吸入氧濃度(FiO2)= 21%。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中維持室溫26℃～28℃。

1.3 標(biāo)本采集及處理實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)抽取3 ml動(dòng)脈血；然后處死大鼠，立即開(kāi)胸小心分離兩側(cè)肺組織，分離氣管并結(jié)扎右側(cè)主支氣管，取出右肺上葉放入4%中性甲醛中固定24 h，剩余右肺組織稱(chēng)濕重(W)，然后放入80℃電熱恒溫干燥箱烘烤至恒重后稱(chēng)干重(D)，計(jì)算肺組織W/D比。用冰生理鹽水對(duì)左肺進(jìn)行肺泡灌洗，2 ml×3次，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，將BALF和動(dòng)脈血離心(15 min，4℃)，分別留取上清液及細(xì)胞沉淀，上清液置于-80℃冰箱凍存待測(cè)。BALF上清液及血清，以全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定其中的蛋白含量，計(jì)算兩者比值，即是肺的通透指數(shù)(Lung permeability index，LPI)。BALF沉渣用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋?zhuān)鹗先旧蠊忡R下行白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)。采用雙抗體夾心ELISA法(Santa Cruz公司，美國(guó))測(cè)定血清和BALF中TNF-α、IL-8的水平。右肺上葉組織行切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)改變對(duì)照組：C組肺泡和支氣管上內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組：V組肺泡破裂、融合，肺泡間隔明顯增厚，肺間質(zhì)水腫，肺血管旁、肺泡間隔和肺泡內(nèi)都有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。烏司他丁組：U組肺泡破裂減少，肺泡間隔增厚減輕，炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)也明顯減少。病理切片觀察結(jié)果：比較400倍鏡下炎癥細(xì)胞和100倍鏡下肺泡結(jié)構(gòu)的變化；見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 對(duì)照組C組

圖2 模型組V組

圖3 烏司他丁組U組

2.2 各組大鼠肺W/D比值、LPI和BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)通氣結(jié)束時(shí)，V組肺組織W/D比值、LPI及BALF中白細(xì)胞總數(shù)均明顯高于C組和U組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；U組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)(109/L)、肺組織W/D比值以及LPI變化比較

表1 BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)(109/L)、肺組織W/D比值以及LPI變化比較

注：與C組比較，aP＜0.05；與V組比較bP＜0.05。

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2.3 血清及BALF中TNF-α、IL-8的變化V組大鼠血清和BALF中TNF-α水平較C組與U組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而C組與U組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；V組大鼠血清和BALF中IL-8含量較C組與U組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而C組與U組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2、表3。

表2 血清和BALF中TNF-α的比較

表2 血清和BALF中TNF-α的比較

注：與C組比較，aP＜0.05；與V組比較bP＜0.05。

表3 血清和BALF中IL-8的比較

表3 血清和BALF中IL-8的比較

注：與C組比較，aP＜0.05；與V組比較bP＜0.05。

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3 討論

本研究采用大潮氣量(VT=40 ml/kg)機(jī)械通氣2.5 h制備VILI模型，病理結(jié)果顯示：模型組肺泡破裂、融合，肺泡間隔明顯增厚，肺間質(zhì)水腫，肺血管旁、肺泡間隔和肺泡內(nèi)都有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。提示模型制備成功。

評(píng)估肺水腫動(dòng)物模型效果的最簡(jiǎn)單的測(cè)定指標(biāo)是肺組織濕干重(W/D)比值，W/D的變化可反映肺間質(zhì)及肺泡血管通透性改變的程度；WBC計(jì)數(shù)可反映白細(xì)胞的浸潤(rùn)水平。本研究結(jié)果表明，V組W/D、BALF中TP含量及WBC計(jì)數(shù)都顯著高于C組；而U組與C組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果說(shuō)明大潮氣量機(jī)械通氣模式能夠明顯引起肺內(nèi)微循環(huán)通透性增加，出現(xiàn)肺水腫及滲出增加，導(dǎo)致肺損傷的發(fā)生，而烏司他丁的應(yīng)用能夠抑制肺部微循環(huán)通透性的增加，通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)減輕大潮氣量所致VILI，從而對(duì)肺組織起到保護(hù)作用。

TNF-α是肺泡巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞釋放的炎性介質(zhì)。TNF-α除直接對(duì)肺組織細(xì)胞造成損傷外，還可以激活巨噬細(xì)胞釋放其他炎性因子，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放ICAM-1等趨化因子。IL-8為血小板β球蛋白超家族成員，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與血小板因子有關(guān)，能刺激中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的釋放，被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)中導(dǎo)致肺組織損傷的特異性細(xì)胞因子[5]。本研究結(jié)果表明，V組大鼠BALF和血清中TNF-α水平顯著高于C組和U組，提示大潮氣量機(jī)械通氣不但誘導(dǎo)了肺組織局部的促炎因子的過(guò)度表達(dá)，引起肺生物傷，也會(huì)引起血中促炎細(xì)胞因子的增加，誘發(fā)局部炎癥向全身炎性反應(yīng)發(fā)展的趨勢(shì)，腹腔注射烏司他丁可抑制呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷大鼠炎性因子的釋放，減輕肺損傷，至于其抑制炎性反應(yīng)的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，烏司他丁可減輕大鼠VILI，其機(jī)制與抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。

[1]Pinhu L,Whitehead T,Evans T,et a1.Ventilator-associated lung injury[J].Lancet,2003,361:332-340.

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[3]Yu JB,Yao SL.Protective effects of hemin pretreatment combined with ulinastatin on septic shock in rats[J].Chin Med J(Engl), 2008,121:49-55.

[4]何海軍,粱小飛,顏福斌,等.呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷模型構(gòu)建的最佳潮氣量[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,8(9):1643-1645.

[5]Takeyama Y.Significance of apoptotic cell death in systemic complications with severe acute pancreatitis[J].J Gastroenterol,2005, 40(1):1-10.

Effects of ulinastatin on ventilator-induced lung injury in rats.

QI Zhi-chao,ZHU Xiao-bing,LIU Zhi-qun,WU Lun, CHANG Long-hai.Department of Anesthesiology,Hospital of Traditional Chinese Medicine of Zhongshan,Zhongshan 528411, Cuangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of ulinastatin on the ventilator-induced lung injury in rats.MethodsThirty-six healthy male SD rats,weighting 300～350 g,were randomly divided into 3 groups(n=12 every group), control group(group C);mechanical ventilation group(group V)and ulinastatin group(group U).The animals were anesthetized with intraperitoneal 20%urethane solution 1.4g/kg and tracheostomized.The femoral artery and vein were cannulated for blood sampling and drug administration.The animals were mechanically ventilated for 2.5 h(VT=40 ml/kg,RR 40 bpm,I: E=1:1,FiO22l%).group U was given ulinastatin about 10 000 u/100 g intraperitoneally 30 minutes before the experiment start,while in groups V and C，the rats were given equal volume of normal saline nstead of ulinastatin.Aterial blood samples were collected at the end of ventilation.The animals were then sacrificed and the lungs were removed for microscopic examination and determination of the content of TNF-α,IL-8,and W/D lung weight ratio,WBC count，total protein(TP)，TNF-α,IL-8,concentrations in broncho-alveolar lavage nuid(BALF).ResultsCompared with those in group C，the contents of TNF-α,IL-8,1ung permeability index(LPI),WBC count and W/D ratio in group V were significantly increased(All theP＜0.05).Compared with those in group V,the contents of TNF-α,IL-8,LPI,WBC count and W/D ratio in group U were significantly decreased(All theP＜0.05).The pathological damage was attenuated in group U compared with that in group V.ConclusionUlinastatin can attenuate the ventilator-induced lung injury through inhibition of inflammatory response in rats.

Ulinastatin;Lung injury;Respiratory distress syndrome;Adult;Inflammatory cytokines

R-332

A

1003—6350（2014）01—0010—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.01.0003

2013-07-29)

廣東省中醫(yī)藥管理局科研立項(xiàng)(編號(hào)：20112051)；中山市科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：20113A066)

戚志超。E-mail：qzc99@21cn.com