楊 艷,張秀麗
(1.山西省食品藥品檢驗所,山西太原 030001;2.繁峙縣人民醫(yī)院,山西繁峙 034300)
保和丸始載于《丹溪心法》,最早為水丸,由焦山楂、炒六神曲等8味藥組成,具消食、導(dǎo)滯、和胃作用,主要用于食積停滯、脘腹脹滿等癥?,F(xiàn)有161個生產(chǎn)企業(yè),216個批準文號,大、小蜜丸、水丸和濃縮丸4種劑型。濃縮丸執(zhí)行標準為《衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑第七冊,除性狀外,僅收載有3味藥的顯微鑒別。為控制本產(chǎn)品質(zhì)量,故擬增加非標方法陳皮中橙皮苷及連翹中連翹酯苷A的含量測定項。
儀器:WATERS Acquity UPLC超高效液相色譜儀,二極管陣列檢測器(沃特世科技有限公司)。
試藥:乙腈為色譜純;水為純化水;冰醋酸為分析純;其他試劑均為分析純。
對照品:連翹酯苷A、橙皮苷(供含測用,批號分別為L-012-110921、110721-200613),均購于中國藥品生物制品檢定所。
樣品:藥都制藥集團股份有限公司(生產(chǎn)批號:110304)。
2.1.1 色譜柱的選擇 a)資生堂 C18柱(5 μm,4.6 mm ×250 mm);b)自裝柱富士填料 C18(5 μm,4.6 mm × 250 mm);c)Allitima C18(5 μm,4.6 mm ×250 mm)。分離良好,柱溫: 室溫,流 速:0.7 mL·min-1。
2.1.2 流動相的選擇 實驗過程中共選擇了以下2種流動相系統(tǒng):
a)流動相A為乙腈,流動相B為0.5%冰醋酸溶液,線性梯度洗脫:0 min— A∶B=10∶90;60 min—A∶B=50∶50;b)流動相A為甲醇,流動相 B為0.5%冰醋酸溶液[1],線性梯度洗脫:0 min—A∶B=10∶90;60 min— A∶B=50∶50。
結(jié)果表明,流動相系統(tǒng)中以第一種,即流動相A為乙腈,流動相 B為0.5%冰醋酸溶液,梯度洗脫0 min—A∶B=10∶90;60 min— A∶B=50∶50為最佳,譜圖上各個色譜峰的分離度較好,保留時間適中。因此選此流動相作為保和丸的含量測定的流動相(見表1)。
表1 流動相 %Table 1 Mobile Phase %
結(jié)果:采用以上色譜柱及流動相均能達到良好的分離效果(見圖1~3)。
圖1 連翹酯苷A對照品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC Chromatogram Map of Forsythiaside A Controls
圖2 橙皮苷對照品HPLC色譜圖Fig.2 HPLC Chromatogram Map of Hesperidin Controls
圖3 保和丸供試品HPLC色譜圖(1.連翹酯苷A對照品,2.橙皮苷對照品)Fig.3 Baohe Pills and Samples HPLC Chromatogram Map(1.horsythiaside A controls,2.hesperidin controls)
2.1.3 檢測波長的選擇 參照《中國藥典》2010年版一部連翹藥材、陳皮藥材[含量測定]項下方法[2],選擇二極管陣列檢測器,波長范圍190 nm~400 nm,提取280 nm波長處的色譜圖,色譜圖分離良好。
2.2.1 提取溶劑的考察 分別采用50%甲醇、70%甲醇、85%甲醇、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇超聲提取及加熱回流法[3],通過比較,采用70%甲醇加熱回流提取法效果最佳。
2.2.2 提取時間的考察 采用加熱回流提取法,分別加熱30 min、45 min、60 min,結(jié)果見表2。
表2 提取時間考察結(jié)果 mg·g-1Table 2 The Inspection Results of Extraction Time mg·g-1
結(jié)果表明:加熱回流45 min與60 min含測結(jié)果雖相差不多,但考慮到能使大蜜丸充分溶散,故將加熱回流時間定為60 min。
分別取處方中除連翹、陳皮外的全部藥味,按本品工藝及供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液,注入液相色譜儀進行測定,結(jié)果表明:在連翹酯苷A、橙皮苷保留時間處無干擾。
用不同儀器:日本島津LC-2010AHT型高效液相色譜儀,Agilent1200高效液相色譜儀;不同色譜柱:a)資生堂 C18柱(5 μm,4.6 mm×250 mm);b)自裝柱 富 士 填 料 C18(5 μm,4.6 mm× 250 mm);c)AllitimaC18(5 μm,4.6 mm ×250 mm),均能達到良好的分離效果。
精密稱取連翹酯苷A對照品9.56 mg,置100 mL量瓶中,加70%甲醇使溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。另精密稱取橙皮苷10.18 mg,置50 mL量瓶中,加70%甲醇使溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。按不同進樣量依法測定,以峰面積值為縱坐標,進樣量為橫坐標,繪制標準曲線,測得連翹酯苷A回歸方程為:A=1E+0.6X+806.4,r2=0.999,表明在0.019 ~ 0.956 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系;橙皮苷回歸方程為:A=3E+0.6X+32 918,r2=0.999,表明在0.102 ~ 2.036 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。
取同一供試品(批號110304)溶液,同一進樣量,連續(xù)進樣6次,按實驗條件依法測定,結(jié)果RSD連翹酯苷A為2.2%,橙皮苷為0.3%,符合要求。
取同一供試品(批號110304)溶液,每隔一定時間同一進樣量,按實驗條件依法測定,結(jié)果表明供試液在36 h內(nèi)穩(wěn)定,RSD分別為:連翹酯苷A為2.7%,橙皮苷為1.0%,符合要求。
按擬訂含量測定方法,對同一批號(批號110304)的6份樣品進行平行實驗,依法測定,平均含量連翹酯苷 A 為0.684 5 mg·g-1,橙皮苷為4.358 0 mg·g-1;RSD:連翹酯苷A為1.4%,橙皮苷為0.79%。
采用加樣回收法,取上述重復(fù)性實驗所用的樣品(1103041批),取1 g(9份),精密稱定,分別精密加入連翹酯苷 A 對照品約0.5 mg、0.7 mg、0.8 mg,橙皮苷對照品約3.4 mg、4.3 mg、5.3 mg,按擬定含測方法制備,依法測定,計算回收率,結(jié)果見表3。
回收率=[測得總量-(取樣量×重復(fù)性測得含量)]/加入對照品量×100%。
表3 回收率測定結(jié)果Table 3 Determination Results of Recovery Rate
根據(jù)中國藥典2010年版一部項下規(guī)定,結(jié)合連翹、陳皮含量限度,按處方量及轉(zhuǎn)移率30%計算,暫定限度為:本品每克含連翹以連翹酯苷A計,不得少于0.1 mg·g-1,含陳皮以橙皮苷(C28H34O15)計,不得少于1.2 mg·g-1。
依法對107批次樣品進行測定,測得結(jié)果分別為橙皮苷:最低0.232 mg·g-1,最高4.871 mg·g-1,107批次濃縮丸50批次不合格,占46.7%;連翹酯苷A最低0.064 mg·g-1,最高2.391 mg·g-1,107 批次濃縮丸6批次不合格,占5.6%。
不僅無法實現(xiàn)本品的標準可控和質(zhì)量安全有效的目標,而且難以發(fā)現(xiàn)以次充好、以假充真、偷工減料等違法行為。因此,必須進一步提高和完善本品的現(xiàn)行標準。
本次抽驗107批次樣品標準檢驗和探索研究發(fā)現(xiàn),雖未發(fā)現(xiàn)擅自不按處方投料、改變工藝等違法行為,但質(zhì)量方面的問題比較突出。
本品現(xiàn)行標準僅有顯微鑒別,未能采用一測多評等專屬性強、靈敏度高的先進技術(shù)手段和方法進行鑒別和含量測定,無法實現(xiàn)對本品整體質(zhì)量的有效控制。因此,本品現(xiàn)行標準中應(yīng)積極引進先進的技術(shù)手段和方法,以確保質(zhì)量控制的全面準確和科學(xué)深入。
[1]梁 艷,郜鳳香.高效液相色譜法測定木香分氣丸中橙皮苷含量[J].中國藥業(yè),2013,22(8):52-53.
[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2010年版一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.
[3]孟 和,朱艷紅,吳學(xué)軍.HPLC法測定保和丸中連翹苷的含量[J].中國藥事,2013,27(3):312-314.