韓兆蓮，許曉曦

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

新型食品添加劑LfcinB對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

韓兆蓮，許曉曦*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

研究了LfcinB作為免疫強(qiáng)化劑以及營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。主要應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)LfcinB對(duì)人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞（Jurkat細(xì)胞）活力的影響，應(yīng)用雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)分析LfcinB抑制Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)的作用方式。研究結(jié)果證實(shí)，LfcinB對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖的影響與LfcinB的作用時(shí)間和濃度呈正相關(guān)，而且LfcinB主要時(shí)通過(guò)誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞發(fā)生早期凋亡來(lái)抑制其增殖，并且其誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞早期凋亡的最佳濃度和時(shí)間分別為200μg/mL和48 h。

牛乳鐵蛋白素；Jurkat細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

牛乳鐵蛋白素（LfcinB）是牛乳中乳鐵蛋白在酸性環(huán)境下經(jīng)胃蛋白酶作用N端釋放的一小段具有廣譜抗菌作用的生物活性肽。乳鐵蛋白素作為食品保存劑、抗氧化劑、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、免疫強(qiáng)化劑、免疫調(diào)節(jié)劑等在食品領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[1]。LfcinB不含稀有氨基酸和外源化學(xué)成分，是健康安全的天然物質(zhì)。LfcinB作為食品添加劑可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)活性，增強(qiáng)對(duì)疾病的抵抗力[2]；提高產(chǎn)品乳化性能，促進(jìn)脂肪消化吸收[3]；具有廣譜的抗菌性和抗脂質(zhì)氧化的作用[4-5]，故可用作防霉劑和抗氧化劑。近期研究，LfcinB對(duì)腫瘤細(xì)胞也具有一定的抑制作用[6-12]。本實(shí)驗(yàn)深入探討了LfcinB抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)理，為L(zhǎng)fcinB在食品中，特別是保健食品中作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、免疫強(qiáng)化劑、免疫調(diào)節(jié)劑等的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Jurkat，Clone E6-1人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞（細(xì)胞編號(hào)TIB-152）：美國(guó)菌種保藏中心；LfcinB（氨基酸序列FKCRRWQWRM KKLGA PSITCVRRAF）：上海楚肽生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%熱滅活胎牛血清的RMPI1640完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37℃，CO2濃度為5%，隔天換液，以保持細(xì)胞最佳生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前均采用血清饑餓法處理24 h。

1.3 CCK-8法檢測(cè)LfcinB對(duì)Jurkat細(xì)胞增值抑制率的影響

1.3.1 CCK-8法

將藥物刺激后的細(xì)胞移入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按照試劑盒操作說(shuō)明每孔添加適量的CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450 nm處檢測(cè)各孔的吸光度值，并計(jì)算增殖抑制率。

1.3.2 LfcinB的濃度對(duì)Jurkat細(xì)胞增值抑制率的影響

Jurkat細(xì)胞分別在濃度為0、50、100、200、400μg/mL的LfcinB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，利用CCK-8法測(cè)定增值抑制率，每組實(shí)驗(yàn)平行4次。

1.3.3 LfcinB的作用時(shí)間對(duì)Jurkat細(xì)胞增值抑制率的影響

Jurkat細(xì)胞在濃度為200μg/mL的LfcinB培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)24、48、72 h后，利用CCK-8法測(cè)定增值抑制率，每組實(shí)驗(yàn)平行4次。

1.4 Annexin-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

1.4.1 Annexin-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)

不同分組的LfcinB作用Jurkat細(xì)胞后，加入195μL Annexin-FITC結(jié)合液和5μL Annexin-FITC染色液，室溫避光孵育45min，然后離心收集細(xì)胞并加入190μL Annexin-FITC結(jié)合液和10μLPI染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，每個(gè)EP管最終的體積為500μL，上機(jī)前用200目篩網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4.2 LfcinB的濃度對(duì)Jurkat細(xì)胞早期凋亡的影響

Jurkat細(xì)胞分別在濃度為0、50、100、200、400μg/mL的LfcinB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，按照上述方法處理，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Jurkat細(xì)胞的早期凋亡率。

1.4.3 LfcinB的作用時(shí)間對(duì)Jurkat細(xì)胞早期凋亡的影響

Jurkat細(xì)胞在濃度為200μg/mL的LfcinB培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)24、48、72 h后，按照上述方法處理，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Jurkat細(xì)胞的早期凋亡率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行多實(shí)驗(yàn)組均數(shù)與對(duì)照組均數(shù)比較的ANOVA中的Donnett-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 LfcinB的濃度對(duì)Jurkat細(xì)胞增值抑制率的影響

不同濃度的LfcinB對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖的影響不同，結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1中可以得出，Jurkat細(xì)胞的增值抑制率是隨著LfcinB濃度的增加而增加，即Jurkat細(xì)胞的活性隨著LfcinB濃度的增加而降低。結(jié)果顯示，濃度為200μg/mL和400μg/mL的LfcinB對(duì)Jurkat細(xì)胞的增殖抑制率較高，然而這兩個(gè)濃度對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的增值抑制率差距不大，從節(jié)約原料的角度出發(fā)，選擇濃度為200μg/mL作為L(zhǎng)fcinB的最佳抑制濃度。

圖1 不同濃度的LfcinB對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effectsof different LfcinB concentration on Jurkat cells

2.2 LfcinB的作用時(shí)間對(duì)Jurkat細(xì)胞增值抑制率的影響

圖2為L(zhǎng)fcinB作用時(shí)間不同的Jurkat細(xì)胞增值抑制率。

圖2 LfcinB的作用時(shí)間對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effectsof different LfcinB action timeon Jurkat cells

由圖2可知，隨著作用時(shí)間的增加，LfcinB對(duì)Jurkat細(xì)胞的增值抑制率有所增加，但增加幅度不大。即LfcinB的作用時(shí)間對(duì)增值抑制率的影響不大。

2.3 不同濃度的LfcinB對(duì)Jurkat細(xì)胞早期凋亡率的影響

圖3為不同濃度的LfcinB作用Jurkat細(xì)胞24 h后早期凋亡率的結(jié)果。

由圖3可知，在同一作用時(shí)間內(nèi)，Jurkat細(xì)胞的早期凋亡率隨著LfcinB濃度的增大而增加，但是200μg/mL和400μg/mL組Jurkat細(xì)胞的早期凋亡率差異不顯著。

2.4 LfcinB的作用時(shí)間對(duì)Jurkat細(xì)胞早期凋亡率的影響

圖4是濃度為200μg/mL的LfcinB作用Jurkat細(xì)胞不同時(shí)間后早期凋亡率的結(jié)果。

由圖4可知，對(duì)于同一作用濃度，不同作用時(shí)間的LfcinB來(lái)說(shuō)，72 h時(shí)Jurkat細(xì)胞的早期凋亡率（Q4）較前兩個(gè)時(shí)間比較，有所降低，此結(jié)果表明，LfcinB作用誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞早期凋亡的最佳作用時(shí)間為48 h，而晚期凋亡或壞死細(xì)胞（Q2）的比例卻有所增加。

圖3 不同濃度的LfcinB對(duì)Jurkat細(xì)胞早期凋亡的影響Fig.3 Effectsof different LfcinB concentration on early apop tosisof Jurkat cells

圖4 LfcinB的作用時(shí)間對(duì)Jurkat細(xì)胞早期凋亡的影響Fig.4 Effectsof different LfcinB action tim eon early apoptosisof Jurkat cells

3 討論

LfcinB對(duì)膀胱癌、肺癌、食道癌及腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)防與抑制作用在1999年被Ushida所證明[13]，但作用機(jī)制尚未完全證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)利用CCK-8法和雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)分析得出LfcinB是通過(guò)促進(jìn)Jurkat細(xì)胞發(fā)生早期凋亡來(lái)抑制Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到抗腫瘤作用，對(duì)LfcinB抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了初步探究，此結(jié)果為L(zhǎng)fcinB作為免疫強(qiáng)化劑以及營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

[1]胡志和,龐廣昌,陳慶森.牛乳鐵蛋白及乳鐵素的生產(chǎn)與應(yīng)用現(xiàn)狀[J].食品科學(xué),2006,27(6):247-251

[2]李忠清,王亮.牛乳鐵蛋白肽的研究現(xiàn)狀與應(yīng)用前景[J].食品科學(xué),2011,32(13):369-373

[3]M Tomta.Bovine lactoferrin and lactoferricin derived from milk: productionand applications[J].Biochem CellBiology,2002,80:109-112

[4]邢芳芳,印遇龍,黃瑞林.重組牛乳鐵蛋白素在大腸桿菌中的表達(dá)[J].食品科學(xué),2008,29(4):221-224

[5]史芳芳,王亮,呂自力.牛乳鐵蛋白多肽的合成及抗菌活性試驗(yàn)[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,18(1):20-23

[6]Cho E,Smith-WarnerSA,Spiegelman D,etal.Dairy foods,calcium, and colorectal cancer:a pooled analysis of 10 cohort studies[J].J NatlCancer Inst,2004,96:1015-1022

[7]MADER JS,SALSMAN J,CONRADDM,etal.Bovine lactoferricin selectively inducesapoptosis in human leukemiaand carcinoma cell lines[J].MolCancer Ther,2005,4(4):612-624

[8]Masaaki Iigo,David B.Alexander,Ne Longetal.Anticarcinogenesis pathways activated by bovine lactoferrin in themurine small intestine[J].Biochimie,2009(91):86-101

[9]Xu XX,Jiang HR,Li HB,et al.Apoptosis of stomach cancer cell SGC-7901 and regulation of AKT signalingway by bovine lactoferrin[J].JDairy Sci,2010,93(6):2344-2350

[10]Suzanne JFurlong,Jamie SMader.Bovine lactoferricin induces caspase-independent apoptosis in human B-lymphoma cells and extends the survival of immune-de ficientmicebearing B-lymphoma xenografts[J].Experimentaland MolecularPathology,2010,88:371-375

[11]LiWY,LiQW,Han ZS,et al.Growth suppression effscts of recombinant adenovirus expressing human lacoferrin on cervical cancer in vitroand in vivo[J].Cancer BiotherRadiopharm,2011,26(40):477-483

[12]Wang J,LiQ,Ou Y,etal.Inhibition of tumorgrowth by recombinant adenovirus containing human lactoferrin through in ducing tumor cell apoptosis in mice bearing EMT6 breast cancer[J].Arch Pharm Res,2011,34(6):987-995

[13]Ushida Y.Possible chemopreventive effectsof bovine lactoferrin on esophagus and lung carcinogenesis in the rat[J].Jpn JCancer Res, 1999,90:262-267

Inbibitional Effects of LfcinB as One New Food Additives on Cell Grow th of Cancer

HAN Zhao-lian，XUXiao-xi*

（College Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China）

Inhibition ofcancer cells from LfcinBas immune-enhancerand nutrientsupplementswas researched. Thisexperimentmeasured thevitalityof Jurkatcellsby CCK-8 and analysed themodeofaction from LfcinBeffect to human acute T lymphocyte leukemia cells（Jurkatcells）by doublemarker flow cytometry.According to the results，the effects of LfcinB to Jurkat cells on proliferation inhibition were positively related to the action concentration and time.And the proliferation inhibition of Jurkatcellsby LfcinBwasmainly induced by the early apoptosisratio，and thebestconcentrationand timetoinduce Jurkatcellsearlyapoptosiswas200μg/mLand48h.

Lfcin B；Jurkatcell；apoptosis

2013-12-12

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.005

韓兆蓮（1986—），女（滿(mǎn)），碩士研究生，主要研究方向：乳品營(yíng)養(yǎng)與安全。

*通信作者