劉慧麗，梁麗貞，吳春麗

促紅細(xì)胞生成素和血管緊張素受體拮抗劑對(duì)腦缺血再灌注后梗死體積和腦組織水腫的影響

劉慧麗，梁麗貞，吳春麗

目的 研究促紅細(xì)胞生成素(EPO)和血管緊張素受體拮抗劑(ARB)對(duì)腦缺血后的腦保護(hù)作用。方法 采用健康的SD大鼠，線栓法阻斷一側(cè)大腦中動(dòng)脈血流2 h，再灌注24 h，建立局灶性腦缺血再灌注損傷模型(MCAO)，治療組分別予缺血再灌注前后經(jīng)腹腔注射EPO 3 000 IU/(kg·d)，或纈沙坦40 mg/(kg·d)，評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能，測(cè)定其腦梗死體積占全腦體積的百分比、腦組織的含水量。結(jié)果 與缺血再灌注組相比，EPD處理組可改善神經(jīng)功能缺失，減少腦梗死體積，降低梗死組織含水量，且經(jīng)EPD預(yù)處理，改善更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與缺血再灌注組相比，ARB處理組可減少腦梗死體積，降低梗死組織含水量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 EPD和ARB可減少腦梗死體積，降低梗死組織含水量，EPD可明顯改善神經(jīng)功能缺失，經(jīng)EPD和ARB預(yù)處理改善更為明顯，具有良好的腦保護(hù)作用。

促紅細(xì)胞生成素；ARB；腦缺血

0 引言

卒中是引起人類死亡的前三位原因，且生存的病人中至少有一半留有不同程度的殘疾，因此，卒中也成為最重要的嚴(yán)重致殘疾病。目前認(rèn)為，迅速溶栓復(fù)流是腦梗死急性期治療成功的前提和基礎(chǔ)，而確實(shí)的腦保護(hù)則是治療成功的基本保證，兩個(gè)環(huán)節(jié)相互相成，缺一不可。研究和開(kāi)發(fā)腦保護(hù)劑是當(dāng)前的熱點(diǎn)，促紅細(xì)胞生成素(EPO)和血管緊張素受體拮抗劑(Angiotensin receptor blocker,ARB)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的腦保護(hù)作用正日益受到關(guān)注[1-2]。本論文擬研究EPO和ARB對(duì)大鼠腦缺血再灌注(Ischemia-reperfusion，IR)損傷后神經(jīng)神經(jīng)功能缺失、腦水腫、腦梗死體積的影響，以探討EPO和ARB的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠70只，雌雄各半，體重270～320 g，由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 首先SD大鼠禁食12 h，其次，稱取大鼠體重，之后腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉。在大鼠頸部正中切口，長(zhǎng)度約3 cm，分離肌肉及皮下組織，顯示右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，繼續(xù)向上分離頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，夾閉翼腭動(dòng)脈(PPA)、甲狀腺上動(dòng)脈、枕動(dòng)脈。在ECA近分叉插入制備好的栓子，深度為18～20 mm[3-4]。經(jīng)CCA分叉處、ICA進(jìn)入顱底至大腦前動(dòng)脈(ACA)，阻斷大腦中動(dòng)脈(MCA)血流，固定栓子。再灌注時(shí)再次麻醉大鼠，栓子退回至CCA的分叉處，實(shí)現(xiàn)再灌注。治療組分別予缺血再灌注前后經(jīng)腹腔注射EPO 3 000 IU/(kg·d)，或纈沙坦40 mg/(kg·d)。

1.2.2 動(dòng)物分組 將符合實(shí)驗(yàn)要求的SD大鼠按以下分為7組，每組10只。①空白對(duì)照組(A組)：MCAO前后不用藥物干預(yù)；②促紅細(xì)胞生成素處理組(B組)：再灌注后給予促紅細(xì)胞生成素7 d，1次/d，每次3 000 U/kg；③ARB處理組(C組)：再灌注后使用ARB；④促紅細(xì)胞生成素預(yù)處理組(D組)：再灌注前給予促紅細(xì)胞生成素，3 000 U/kg；⑤ARB預(yù)處理組(E組)：再灌注前給予ARB處理；⑥促紅細(xì)胞生成素和ARB聯(lián)合使用組(F1組)：再灌注前給予促紅細(xì)胞生成素和ARB；⑦促紅細(xì)胞生成素和ARB聯(lián)合使用組(F2組)：再灌注后給予促紅細(xì)胞生成素和ARB。

1.2.3 神經(jīng)功能評(píng)分 0分：無(wú)神經(jīng)功能缺失；1分：對(duì)側(cè)前肢屈曲；2分：向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

1.2.4 腦含水量(BWC)測(cè)定(干濕重法) 取大鼠腦組織，分別將缺血側(cè)和梗死對(duì)側(cè)大腦半球組織放置于稱量杯，分析天平稱濕重。恒溫箱內(nèi)100 ℃烘烤24 h后取出，稱干重(兩次干重之差≤0.2 mg)，腦組織含水量計(jì)算公式：腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.5 腦梗死體積率測(cè)定(TTC染色方法) 在冠狀切面切約2 mm厚的5片腦片，予2%的TTC溶液中孵育15～20 min，溫度37 ℃。予4%多聚甲醛固定，24 h后觀察。采用TD2000圖像分析系統(tǒng)測(cè)定腦梗死體積。采用Swanson方法糾正水腫對(duì)梗死灶體積的影響，梗死面積=非缺血側(cè)半球面積-缺血側(cè)半球未梗死區(qū)面積，梗死側(cè)體積和非缺血側(cè)半球體積的百分比(%)來(lái)表示梗死灶體積。見(jiàn)圖1。

圖1 腦梗死體積

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分 與缺血再灌注組比較，治療組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，治療組中以促紅細(xì)胞生成素和ARB預(yù)處理組神經(jīng)功能缺血評(píng)分最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，促紅細(xì)胞生成素預(yù)處理組評(píng)分低于缺血再灌注后使用促紅細(xì)胞生成素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但ARB治療組兩組分值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 促紅細(xì)胞生成素和ARB對(duì)大鼠腦缺血神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響±s)

注：與缺血再灌注組比較，*P<0.05；與EPO處理組比較，#P<0.05

2.2 腦含水量 本實(shí)驗(yàn)觀察了MCAO后大鼠腦組織的含水量，治療組均可減少腦組織含水量，與缺血再灌注組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，促紅細(xì)胞生成素和ARB預(yù)處理組減少腦組織含水量最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，促紅細(xì)胞生成素預(yù)處理組優(yōu)于缺血再灌注后使用促紅細(xì)胞生成素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但ARB治療組兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 促紅細(xì)胞生成素和ARB對(duì)大鼠腦缺血腦組織含水量的比較(ng/mL)

注：與缺血再灌注組比較，*P<0.01；與EPO處理組比較，#P<0.01

2.3 腦梗死體積 大鼠腦缺血后，觀察大體標(biāo)本，看到缺血側(cè)腦組織較對(duì)側(cè)體積增大，TTC染色呈白色的梗死灶，周圍正常組織呈紅色。治療組腦梗死體積率與缺血再灌注組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，促紅細(xì)胞生成素和ARB預(yù)處理組減少腦梗死體積最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，促紅細(xì)胞生成素預(yù)處理組優(yōu)于缺血再灌注后使用促紅細(xì)胞生成素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但ARB治療組兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表3 促紅細(xì)胞生成素和ARB對(duì)大鼠腦缺血腦梗死體積的比較±s)

注：與缺血再灌注組比較，*P<0.01；與EPO處理組比較，#P<0.05

3 討論

EPO是調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的糖蛋白，主要產(chǎn)生于胎兒的肝臟和成人的腎臟，通過(guò)神經(jīng)保護(hù)、抗細(xì)胞凋亡、抗炎、抗氧化、促進(jìn)血管生成、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育及營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)等在中樞系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要作用。國(guó)內(nèi)學(xué)者的研究認(rèn)為，促紅細(xì)胞生成素是一種神經(jīng)保護(hù)因子，對(duì)局灶性和全腦梗死均有保護(hù)作用[5-6]。Byts等[7]認(rèn)為，腦缺血、腦出血及腦外傷均可引起EPO及其受體在腦內(nèi)多種細(xì)胞中表達(dá)，且表達(dá)明顯上調(diào)，EPO可通過(guò)血腦屏障抗炎、抗凋亡等發(fā)揮腦保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注前使用EPO與缺血再灌注后使用相比較，可明顯改善神經(jīng)功能，減少梗死體積，降低梗死組織含水量。EPO對(duì)缺血大鼠腦組織的保護(hù)作用可能通過(guò)減少神經(jīng)細(xì)胞的壞死和凋亡，因而也減少了腦組織的梗死體積和腦水腫，從而抑制缺氧缺血后腦皮層尤其是缺血半暗帶細(xì)胞的凋亡。與Price等[8]使用EPO衍生物的研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腹腔給予外源性EPO起到了腦保護(hù)作用，間接地證實(shí)了EPO可以進(jìn)入顱內(nèi)發(fā)揮作用。除了特異性轉(zhuǎn)運(yùn)體外，還可能通過(guò)受損的血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)發(fā)揮作用。而且本研究同國(guó)內(nèi)外臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相一致。國(guó)外學(xué)者Fletcher等[9]通過(guò)阻塞大腦中動(dòng)脈1 h，再灌注24 h建立動(dòng)物模型，聯(lián)合使用EPO 和胰島素樣生長(zhǎng)因子，發(fā)現(xiàn)24 h后的梗死面積明顯縮小，90 d后的神經(jīng)功能明顯改善。Yuen等[10]的研究結(jié)果同樣證實(shí)，EPO可以縮小缺血面積，提高感覺(jué)、神經(jīng)功能。Dang等[11]通過(guò)阻塞大鼠中動(dòng)脈制造局造性腦缺血模型，血管內(nèi)局部注人重組促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)，觀察其腦保護(hù)作用，研究發(fā)現(xiàn)，其可以改善神經(jīng)功能，縮小腦缺血48 h后的梗死體積，減輕腦水腫和細(xì)胞損害。臨床試驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，rhEPO有腦保護(hù)作用。Ehrenreich等[12]通過(guò)入選年齡<80歲，彌散加權(quán)磁共振成像(DWMRI)證實(shí)大腦中動(dòng)脈區(qū)域缺血，起病8 h內(nèi)，有神經(jīng)功能缺失的患者，研究rhEPO在男性缺血性中風(fēng)患者治療中的有效性。通過(guò)Barthel Index，modified Rankin scale評(píng)價(jià)30 d的神經(jīng)功能，證明可以改善預(yù)后，且腦脊液中rhEPO是對(duì)照組中的60～100倍，說(shuō)明rhEPO可以通過(guò)血腦屏障。進(jìn)一步通過(guò)MRI觀察rhEPO可以縮小梗死體積。

生化及神經(jīng)生物學(xué)表明，腦內(nèi)存在獨(dú)立調(diào)節(jié)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin angiotensin system，RAS)，研究表明，ARB能通過(guò)血腦屏障，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的AT1受體特異性結(jié)合，從而阻斷血管緊張素Ⅱ的作用，說(shuō)明其對(duì)腦血管具有保護(hù)作用。多項(xiàng)研究顯示，ARB能預(yù)防或延緩卒中的發(fā)生并提高生存率。

ARB可通過(guò)調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，誘發(fā)炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和自由基損傷及調(diào)節(jié)生物活性物質(zhì)、細(xì)胞因子的釋放等多種途徑參與慢性腦缺血后腦保護(hù)過(guò)程。如：血管緊張素ATI受體拮抗劑可以降低血液中的超氧化物水平，因而可能通過(guò)抗氧化應(yīng)激保護(hù)神經(jīng)元；ARB可以減少興奮性氨基酸通過(guò)NMDA受體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)ACEI和AT1受體拮抗劑分別通過(guò)減少AngⅡ生成和阻斷AngⅡ與受體結(jié)合產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)減輕缺血再灌注損傷。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，ARB能明顯縮小缺血?jiǎng)游锏哪X梗死體積，降低腦組織的含水量，表明ARB對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用。Lou等[13]向雄性大鼠腦室內(nèi)注射伊貝沙坦，觀察神經(jīng)保護(hù)、抗凋亡和炎癥反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)缺血前使用伊貝沙坦預(yù)處理治療可以提高運(yùn)動(dòng)功能，而缺血后使用可以提高感覺(jué)功能，AT1受體拮抗劑的使用降低了缺血后第3天和第7天的梗死體積，降低了第3天凋亡細(xì)胞的數(shù)量，減弱了第3天和7天活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的侵入，而抗凋亡機(jī)制及抑制缺血后的炎癥反應(yīng)，參與了神經(jīng)保護(hù)。Hosomi等[14]對(duì)SD大鼠行缺血再灌注。奧美沙坦灌注7 d，觀察中風(fēng)指數(shù)，腦梗死體積，及血管緊張素Ⅱ和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)定量檢測(cè)。結(jié)果表明，小劑量奧美沙坦無(wú)降壓作用，但能改善中風(fēng)指數(shù)，腦梗死體積、腦水腫，亦能降低缺血區(qū)域血管緊張素Ⅱ、MMP2、MMP9的水平。亦有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，阻塞大鼠中動(dòng)脈1 h，制造短暫性腦缺血模型，單獨(dú)使用AT1受體拮抗劑坎地沙坦或與羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑羅蘇伐他汀聯(lián)合使用，評(píng)估腦梗塞的體積和進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，結(jié)果表明，阻塞前2 h使用坎地沙坦預(yù)處理的，梗塞的體積為(21±5) mm3，阻塞后使用的為(68±29) mm3，對(duì)照組為(109±12) mm3，相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且阻塞前聯(lián)合使用坎地沙坦和羅蘇伐他汀與阻塞前單獨(dú)使用劑坎地沙坦相比差無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療的益處部分是由于eNOS的激活[15]。Faure等[16]研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用EPO和奧美沙坦可改善預(yù)后，明顯提高長(zhǎng)期空間學(xué)習(xí)記憶功能。

總之，EPO是一種不良反應(yīng)小、安全的藥物，可以在腦缺血損傷時(shí)通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織發(fā)揮腦保護(hù)作用，減少梗死體積和腦水腫，且Meta分析亦進(jìn)一步證實(shí)了此觀點(diǎn)[17]。我們期望隨著研究的深入，EPO將作為一種安全高效的神經(jīng)保護(hù)劑應(yīng)用于腦血管病的治療。ARB可從多個(gè)方面干預(yù)慢性腦缺血后的神經(jīng)元、突觸、髓鞘的損害，有明顯腦保護(hù)作用，能明顯減輕慢性腦缺血引起的神經(jīng)損害，為ARB在臨床應(yīng)用于預(yù)防和治療慢性腦缺血提供了理論依據(jù)。

[1] Byts N,Sirén AL.Erythropoietin:a multimodal neuroprotective agent[J].Exp Transl Stroke Med,2009,10(21):1-4.

[2] Sanchis-Gomar F,Perez-Quilis C,Lippi G.Erythropoietin receptor (EpoR) agonism is used to treat a wide range of disease[J].Mol Med,2013,19:62-64.

[3] 李昌植.栓線法制備MCAO模型大鼠研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)研究與臨床,2007,5(11):59-63.

[4] Zhu CZ,Auer RN.Optimal blood glucose levels while using insulin to minimize the size of infarction in focal cerebral ischemia[J].J Neurosurg,2004,101:664-668.

[5] 楊彥玲,朱文俠,陳雅慧,等.促紅細(xì)胞生成素對(duì)腦缺血/灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志,2010,26(2):152-153.

[6] Dang S,Liu X,Fu P,et al.Neuroprotection by local intra-arterial infusion of erythropoietin after focal cerebral ischemia in rats[J].Neurol Res,2011,33(5):520-528.

[7] Byts N,Sirén AL.Erythropoietin:a multimodal neuroprotective agent[J].Exp Transl Stroke Med,2009:21(1):4.

[8] Price CD,Yang Z,Karlnoski R,et al.Effect of continuous infusion of asialoerythropoietin on short-term changes in infarct volume,penumbra apoptosis and behaviour following middle cerebral artery occlusion in rats[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2010,37(2):185-192.

[9] Fletcher L,Kohli S,Sprague SM,et al.Intranasal delivery of erythropoietin plus insulin-like growth factor-I for acute neuroprotection in stroke.Laboratory investigation[J].J Neurosurg,2009,111(1):164-170.

[10]Yuen CM,Leu S,Lee FY,et al.Erythropoietin markedly attenuates brain infarct size and improves neurological function in the rat[J].J Investig Med,2010,58(7):893-904.

[11]Dang S,Liu X,Fu P,et al.Neuroprotection by local intra-arterial infusion of erythropoietin after focal cerebral ischemia in rats[J].Neurol Res,2011,33(5):520-528.

[12]Ehrenreich H,Hasselblatt M,Dembowski C,et al.Erythropoietin therapy for acute stroke is both safe and beneficial[J].Mol Med,2002,8(8):495-505.

[13]Lou M,Blume A,Zhao Y,et al.Sustained blockade of brain AT1 receptors before and after focal cerebral ischemia alleviates neurologic deficits and reduces neuronal injury,apoptosis,and inflammatory responses in the rat[J].Cereb Blood Flow Metab,2004,24(5):536-547.

[14]Hosomi N,Nishiyama A,Ban CR,et al.Angiotensin type 1 receptor blockage improves ischemic injury following transient focal cerebral ischemia[J].Neuroscience,2005,134(1):225-231.

[15]Engelhorn T,Doerfler A,Heusch G,et al.Reduction of cerebral infarct size by the AT1-receptor blocker candesartan,the HMG-CoA reductase inhibitor rosuvastatin and their combination,An experimental study in rats[J].Neurosci Lett,2006,406(1-2):92-96.

[16]Faure S,Oudart N,Javellaud J,et al.Synergistic protective effects of erythropoietin and olmesartan on ischemic stroke survival and post-stroke memory dysfunctions in the gerbil[J].Hypertens,2006,24(11):2255-2261.

[17]Jerndal M,Forsberg K,Sena ES,et al.A systematic review and meta-analysis of erythropoietin in experimental stroke[J].J Cereb Blood Flow Metab,2010,30(5):961-968.

Effects of erythropoietin and angiotensin receptor blocker on histological changes of cerebral infarction size and brain tissue water content

LIU Hui-li,LIANG Li-zhen,WU Chun-li

(Department of Neurology,The Third Hospital of Hangzhou,Hangzou 310009,China)

Objective To explore the protective effects of erythropoietin (EPO) and angiotensin receptor blocker (ARB) after focal cerebral ischemia-reperfusion.Methods The model of focal cerebral ischemia was made by occluding middle cerebral artery (MCAO) for 2 h and reperfusing for 24 h in well SD rats.The rats

an ip injection of either EPO 3 000 IU/(kg·d) or ARB 40 mg/(kg·d) just before the beginning of reperfusion and after reperfusion.The nerve function,changes of infarction volume to whole cerebral volume,brain tissue water content were evaluated.Results Compared with ischemia group,the cerebral infarction volume in EPO-treated group was smaller,and the cerebral water content also decreased,nerve function improved,there were significant differences between the two groups (P<0.05).Compared with ischemia group,the cerebral infarction volume in ARB-treated group was smaller,and the cerebral water content also decreased,there were significant differences between the two groups (P<0.05).Conclusion Erythropoietin and angiotensin receptor blocker can decrease the infarction volume,the cerebral water content,improve nerve function,by erythropoietin and angiotensin receptor blocker preconditioning,the result is more well,and has protective effects on ischemia-reperfusion.

Erythropoietin;Angiotensin receptor blocker;Cerebral ischemia

2013-06-04

浙江省杭州市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 杭州 310009

杭州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(2007A012)