唐娟娟

·論著·

虎杖提取物對(duì)神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用研究

唐娟娟

目的研究虎杖提取物對(duì)神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用, 并探討其作用機(jī)制。方法雄性 SD 大鼠, 隨機(jī)分為對(duì)照組和坐骨神經(jīng)縮狹模型(chronic construction injury, CCI)組。CCI術(shù)后14 d, 應(yīng)用Von Frey法測(cè)定機(jī)械刺激縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT), 觀察口服不同劑量的虎杖提取物對(duì)CCI大鼠機(jī)械性痛覺(jué)超敏的影響。并考察不同劑量虎杖提取物對(duì)CCI大鼠脊髓p-ERK、p-P38水平及小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響。結(jié)果虎杖提取物可明顯升高CCI大鼠術(shù)側(cè)的MWT值(P＜0.05), 而對(duì)正常大鼠的MWT值沒(méi)有顯著影響(P＞0.05)。同時(shí)虎杖提取物可顯著抑制CCI模型大鼠脊髓ERK和p38的磷酸化, 并顯著抑制IBA-1表達(dá)增加。結(jié)論虎杖提取物對(duì)CCI誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺(jué)超敏具有顯著性的抑制作用, 且鎮(zhèn)痛作用維持時(shí)間長(zhǎng)于嗎啡, 其機(jī)制可能是通過(guò)抑制脊髓水平ERK和p38的磷酸化, 及通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化而實(shí)現(xiàn)。

虎杖提取物；CCI；神經(jīng)病理性疼痛；小膠質(zhì)細(xì)胞

神經(jīng)病理性疼痛是一種由神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷或產(chǎn)生病變而導(dǎo)致的慢性疼痛, 其病理機(jī)制十分復(fù)雜, 臨床上總體療效不佳, 迫切需要尋找新的鎮(zhèn)痛藥物。而中醫(yī)鎮(zhèn)痛已有上千年歷史, 在中藥驗(yàn)方中篩選新的鎮(zhèn)痛藥物并闡明其作用機(jī)制可能為神經(jīng)病理性疼痛的治療提供新思路和先導(dǎo)化合物。

中藥虎杖為蓼科植物虎杖的干燥根莖。中醫(yī)認(rèn)為其利濕退黃, 通常用于血瘀、濕熱諸證。能夠活血散瘀、祛風(fēng)通絡(luò)、清熱利濕等, 主治跌打損傷、風(fēng)濕痹痛等。虎杖的主要生物活性成分由蒽醌類(lèi)化合物大黃素、大黃酚、芪類(lèi)衍生物白藜蘆醇和多種苷類(lèi)衍生物等組成?，F(xiàn)在藥理研究表明, 虎杖提取物具有抑制免疫反應(yīng)、抗凝、強(qiáng)心、保肝和清除氧自由基等多種作用。有研究提示, 虎杖提取物的抗炎作用, 其作用可能與抑制炎癥介質(zhì)PGE2和NO的產(chǎn)生并抑制細(xì)胞免疫有關(guān)［1-3］。同時(shí)也有文獻(xiàn)表明, 虎杖提取物可以通過(guò)抑制過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)的表達(dá)來(lái)防治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎［4］。

虎杖提取物是否對(duì)神經(jīng)病理性疼痛具有治療作用, 這方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究制備大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型(chronic constriction injury of the sciatic nerve, CCI), 考察虎杖提取物對(duì)神經(jīng)損傷造成的機(jī)械性痛覺(jué)超敏的治療作用并研究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥物 虎杖提取物由中國(guó)藥科大學(xué)臨床藥學(xué)教研室提供, 每克虎杖提取物相當(dāng)于9.0 g虎杖生藥材。鹽酸嗎啡(沈陽(yáng)第一制藥廠)。

1.2動(dòng)物 健康成年雄性SD(sprague-dawley)大鼠, 體重為180～220 g, 由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供, 生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(浙)2008-0033。

1.3儀器 足底測(cè)試儀Von-Frey測(cè)痛儀CA91367(Woodland Hills公司)；電泳儀(美國(guó)Biorad公司)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果均以( x-±s)表示, 用SPSS 11.5分析軟件進(jìn)行組間t檢驗(yàn), 行為學(xué)、免疫印跡以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型的建立 通過(guò)寬松結(jié)扎大鼠坐骨神經(jīng)制備CCI神經(jīng)病理性疼痛模型。術(shù)后14 d測(cè)定機(jī)械性縮足反射閾值(Mechanical Withdrawal Threshold, MWT),較基礎(chǔ)痛閾下降40 %以上者視為CCI模型成功, 可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2虎杖提取物對(duì)CCI大鼠機(jī)械性縮足反射閾值的影響篩選CCI造模成功的大鼠, 于手術(shù)后第14天開(kāi)始給藥。分CCI模型組, 嗎啡組和虎杖提取物治療組, 虎杖提取物治療組又分為2.5 g/kg, 5 g/kg和10 g/kg 3個(gè)不同劑量組, 每組6只。灌胃給藥, 測(cè)定給藥前0 h和給藥后2 h, 4 h, 8 h和24 h的機(jī)械性縮足反射閾值。嗎啡組椎管內(nèi)注射1次鹽酸嗎啡, 劑量為10 μg/只, 注射體積為20 μl/只, CCI模型組則注射相同體積生理鹽水, 嗎啡組和模型組行為學(xué)測(cè)定方法同虎杖提取物治療組。

結(jié)果顯示：與模型組比較, 虎杖提取物兩個(gè)劑量單次給藥后均具有顯著的鎮(zhèn)痛作用, 且具有劑量相關(guān)性(P＜0.05), 見(jiàn)圖1, 同時(shí)作用時(shí)間維持較長(zhǎng), 鎮(zhèn)痛作用＞8 h。而嗎啡給藥4 h后, 其鎮(zhèn)痛基本消失。結(jié)果表明：虎杖提取物顯著抑制CCI導(dǎo)致的大鼠機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏, 且鎮(zhèn)痛作用維持時(shí)間顯著長(zhǎng)于嗎啡。

圖1 虎杖提取物對(duì)CCI模型大鼠機(jī)械刺激縮足反射閾值的影響

2.3虎杖提取物對(duì)正常大鼠機(jī)械刺激縮足反射閾值的影響正常SD大鼠18只, 分為溶媒組和虎杖提取物組?；⒄忍崛∥镏委熃M又分為2.5 g/kg, 5 g/kg和10 g/kg三個(gè)不同劑量組,每組6只。灌胃給藥, 測(cè)定給藥前0 h和給藥后2 h, 4 h, 8 h和24 h的機(jī)械性縮足反射閾值。結(jié)果表明, 虎杖提取物三個(gè)不同劑量對(duì)大鼠的MWT均無(wú)顯著性影響(P＞0.05), 見(jiàn)圖2。

圖2 虎杖提取物對(duì)正常大鼠機(jī)械刺激縮足反射閾值的影響

2.4虎杖提取物抑制CCI誘導(dǎo)的大鼠脊髓p38MAPK和ERK磷酸化水平的影響 大量證據(jù)顯示絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路的激活在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮著重要作用。利用western blotting 方法, 檢測(cè)虎杖提取物對(duì)CCI誘導(dǎo)的脊髓p38MAPK和ERK磷酸化水平異常升高的影響。

結(jié)果顯示：CCI模型下大鼠脊髓組織ERK1/2和p38MAPK磷酸化水平顯著增加, 虎杖提取物高劑量10 g/kg可以顯著抑制CCI誘導(dǎo)的大鼠脊髓組織的ERK1/2和p38MAPK磷酸化水平, 而對(duì)基礎(chǔ)的ERK1/2和p38MAPK磷酸化水平?jīng)]有顯著影響(P＜0.01), 見(jiàn)圖3。

2.5虎杖提取物抑制CCI誘導(dǎo)的大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化近年來(lái)的研究證實(shí), 小膠質(zhì)細(xì)胞主導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)免疫反應(yīng)在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)和維持中發(fā)揮重要作用。脊髓水平的IBA-1(小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記)的表達(dá)上調(diào)可以作為脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的活化的證據(jù)。接下來(lái)檢測(cè)虎杖高劑量10 g/kg干預(yù)對(duì)CCI導(dǎo)致的脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響。結(jié)果顯示：虎杖可以顯著抑制CCI導(dǎo)致的大鼠脊髓組織IBA-1水平的上調(diào),同時(shí)對(duì)基礎(chǔ)情況下的IBA-1水平?jīng)]有顯著影響(P＜0.01), 見(jiàn)圖3。

圖3 虎杖提取物抑制CCI模型大鼠脊髓ERK、p38MAPK的磷酸化, 抑制IBA-1表達(dá)上調(diào)( x-±s, n=6)

3 討論

大量的研究表明：小膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活在神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮著重要作用［5］。神經(jīng)損傷后, 數(shù)小時(shí)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞即可活化, 并持續(xù)數(shù)十天以上?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞釋放大量炎性細(xì)胞因子如IL - 1β、IL - 6、TNF-α等, 細(xì)胞因子MMP-2/9 以及ATP, NO等活性物質(zhì)。這個(gè)活性物質(zhì)通過(guò)作用于痛覺(jué)神經(jīng)元上對(duì)應(yīng)的受體或信號(hào)級(jí)聯(lián)通路, 導(dǎo)致脊髓中樞敏化, 促進(jìn)和參與維持神經(jīng)病理性疼痛［6-8］。椎管內(nèi)給予小膠質(zhì)細(xì)胞的抑制劑米諾環(huán)素可以抑制抑制神經(jīng)損傷導(dǎo)致的機(jī)械性痛覺(jué)超敏。已經(jīng)證明, MAPK家族的兩個(gè)重要成員p38MAPK 和ERK , 尤其是p38MAPK在神經(jīng)損傷導(dǎo)致的小膠質(zhì)細(xì)胞激活過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。p38MAPK和ERK抑制劑都有報(bào)道可以抑制神經(jīng)損傷導(dǎo)致的脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化,并減少促炎細(xì)胞因子釋放［9,10］。

本研究中, 首次發(fā)現(xiàn)虎杖提取物有以下功能：①顯著抑制CCI導(dǎo)致的大鼠機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏, 且鎮(zhèn)痛作用維持時(shí)間較長(zhǎng)；②顯著抑制CCI導(dǎo)致的大鼠脊髓水平ERK和p38MAPK的磷酸化異常性升高；③顯著抑制CCI導(dǎo)致的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨?。因此推測(cè)虎杖提取物的鎮(zhèn)痛作用可能通過(guò)抑制脊髓水平的p38MAPK和ERK異常升高, 進(jìn)而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化而實(shí)現(xiàn)。與研究結(jié)果相類(lèi)似, Tillu及其同事［11］報(bào)道虎杖的主要成分之一, 白藜蘆醇可通過(guò)激活A(yù)MPK, 進(jìn)而抑制感覺(jué)神經(jīng)元中ERK信號(hào)通路而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn),兩個(gè)不同劑量的虎杖提取物均不影響正常大鼠的基礎(chǔ)機(jī)械學(xué)痛閾, 說(shuō)明虎杖提取物對(duì)脊髓水平的正常傷害性感受信息調(diào)制沒(méi)有顯著影響。

嗎啡類(lèi)藥物被廣泛應(yīng)用于治療神經(jīng)病理性疼痛。但是嗎啡的鎮(zhèn)痛作用持續(xù)時(shí)間相對(duì)較短, 為了有效控制疼痛, 需要持續(xù)大劑量給藥, 進(jìn)而帶來(lái)成癮, 耐受和胃腸道不良反應(yīng)等副作用。數(shù)據(jù)表明, 虎杖提取物雖然在短時(shí)的鎮(zhèn)痛效率上不如嗎啡, 但是其鎮(zhèn)痛持續(xù)時(shí)間顯著優(yōu)于嗎啡。10 g/kg虎杖提取物的鎮(zhèn)痛持續(xù)時(shí)間＞8 h, 是5 mg/kg嗎啡的2倍以上。這表明以虎杖作為研究目標(biāo), 從中尋找新的鎮(zhèn)痛藥物具有較大潛力。

［1］ 徐新, 李德明, 徐佳薇, 等.虎杖提取物的抗炎作用及對(duì)一氧化氮生成的影響.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2013, 33(016):1311-1315.

［2］ 張海防, 竇昌貴, 劉曉華, 等.虎杖提取物抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究.藥學(xué)進(jìn)展, 2003, 27(4): 230-233.

［3］ 王斌, 侯建平, 李敏, 等.虎杖提取物對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清PGE-2的影響.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 14(12): 944-945.

［4］ 侯建平.虎杖提取物對(duì)尿酸鈉致痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎家兔滑膜組織PPAR-γ的影響.中藥藥理與臨床, 2010, 26(5):76-79.

［5］ Lewis S.Pain: microglia take control in chronic pain.Nat Rev Neurosci, 2013, 14(3): 154-155.

［6］ Meulders A, Vlaeyen JW.Fear reduction in subacute whiplashassociated disorders: the royal road to recovery? Pain, 2013, 154(3): 330-331.

［7］ Gao Y, Liu H, Deng L, et al.Effect of emodin on neuropathic pain transmission mediated by P2X2/3 receptor of primary sensory neurons.Brain Res Bull , 2011, 84(6): 406-413.

［8］ Piao ZG, Cho IH, Park CK, et al.Minocycline attenuates mechanical allodynia and proinflammatory cytokine expression in rat models of pain facilitation.Pain , 2005, 115(1):71-83.

［9］ Piao ZG, Cho IH, Park CK, et al.Activation of glia and microglial p38 MAPK in medullary dorsal horn contributes to tactile hypersensitivity following trigeminal sensory nerve injury.Pain 2006, 121(3):219-231.

［10］ Ma W, Quirion R.The ERK/MAPK pathway, as a target for the treatment of neuropathic pain.Expert Opin Ther Targets , 2005(9):699-713.

［11］ Tillu DV, Melemedjian OK, Asiedu MN, et al.Resveratrol engages AMPK to attenuate ERK and mTOR signaling in sensory neurons and inhibits incision-induced acute and chronic pain.Mol Pain, 2012(8):1-12.

Analgesic effect of polygonum cuspidatum extract in rat model of neuropathic pain

TANG Juan-juan.
Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

ObjectiveTo study the analgesic effect and mechanism of polygonum cuspidatum extract in the neuropathic pain using rat chronic constriction (CCI) mode.MethodsThe SD rats were randomly divided into control and model groups.After 14 days of CCI, we observe the effect of different doses of polygonum cuspidatum extract on rat mechanical allodynia using vonFrey flinching reflex threshold (mechanical withdrawal threshold, MWT), The levels of p-ERK, p-P38 and the activation of microglial cells in rat spinals were measured by Western blotting.Resultspolygonum cuspidatum extract can significantly increase the value of MWT in CCI rats (P＜0.05), whereas had no significant effect in normal rats (P＞0.05).Meanwhile, polygonum cuspidatum extract significantly inhibited the phosphorylation of ERK and p38, and inhibited the expression of IBA-1 in CCI rat.ConclusionPolygonum cuspidatum extract can inhibit the mechanical allodynia in CCI rat, and the duration is longer than the analgesic effect of morphine.The mechanism may be associated with the inhibition of the phosphorylation of ERK and p38, and inhibition of microglial cell activation in rat spinal.

Polygonum cuspidatum; CCI; Neuropathic pain; Microglial cell

210023 南京中醫(yī)藥大學(xué)生理學(xué)教研室

唐娟娟 E-mail：tangjuanjuan5njmu@126.com