閆天文，滿(mǎn)朝新，劉泳麟，柴云雷，任歡，龐心怡，趙玥明，姜毓君,

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) a.食品學(xué)院；b.國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱150030)

0 引 言

隨著人們生活水平的提高，益生菌食品的消費(fèi)量逐年上升，益生菌添加到食品中的主要方式是直接添加菌體或以益生菌制劑的方式添加。益生菌制劑制備的關(guān)鍵技術(shù)對(duì)乳酸菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)[1-2]。限制乳酸菌高密度培養(yǎng)的主要因素是底物消耗和酸的積累。國(guó)外一些研究者對(duì)限制乳酸菌高密度培養(yǎng)的底物、緩沖鹽、生長(zhǎng)因子等做了大量研究[3-6]。植物乳桿菌屬于乳酸桿菌屬，有很強(qiáng)的發(fā)酵碳水化合物的能力，耐膽鹽，免疫調(diào)節(jié)，拮抗致病菌和抗突變等益生性質(zhì)[7]。本研究采用的植物乳桿菌NDC 75017分離自?xún)?nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中，具有許多益生功能[8-11]。實(shí)驗(yàn)對(duì)影響菌體生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)條件和環(huán)境條件進(jìn)行了研究，提高了菌體活菌數(shù)和生物量，為乳酸菌發(fā)酵劑的制備奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌NDC 75017分離自?xún)?nèi)蒙古通遼地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，Tween-80 1 mL，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀 2 g，檸檬酸氫二銨2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸錳 0.25 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)pH值至5.8。121℃滅菌15 min，用于菌體的活化。

MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂，121℃滅菌15 min，用于菌體計(jì)數(shù)。

增殖培養(yǎng)基：按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)配方配制，121℃滅菌15 min，用于菌體增殖培養(yǎng)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

BCN1360型生物潔凈工作臺(tái)，GL-21M高速冷凍離心機(jī)，滅菌鍋，DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，精密天平與精密pH計(jì)，紫外分光光度計(jì)DU800。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

從-80℃取出菌株復(fù)蘇純化，按2%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中，30℃活化培養(yǎng)兩代。

1.3.2 碳源、氮源、緩沖鹽、生長(zhǎng)因子及培養(yǎng)條件的篩選

將活化好的種子液按2%的比例分別接種至不同種類(lèi)的碳源、氮源、緩沖鹽及不同的培養(yǎng)條件下(不同溫度、pH值)的培養(yǎng)基中。

1.3.3 活菌計(jì)數(shù)

每隔2 h取樣，將發(fā)酵液進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)?0-7～10-9三個(gè)梯度進(jìn)行平板涂布，30℃培養(yǎng)48 h計(jì)數(shù)。

1.3.4 菌體密度的測(cè)定

每隔2 h取樣，發(fā)酵液的菌體密度用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm下測(cè)定。如果菌液過(guò)濃則稀釋一定倍數(shù)使光密度在0.2～1.2之間，菌體密度值為測(cè)定值乘以稀釋倍數(shù)[12]。

1.3.5 菌體干重的測(cè)定

每隔2 h取樣，發(fā)酵液在4 000 r/min條件下離心10 mim。將得到的菌泥用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水洗滌三遍，70℃烘箱烘干至恒重[12]。

1.3.6 pH值的測(cè)定

每隔2 h取樣，用精密pH計(jì)測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的pH值。

1.3.7 葡萄糖質(zhì)量濃度的測(cè)定

采用葡萄糖測(cè)定試劑盒 (葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化氫酶法，上海榮盛生物藥業(yè))，每隔2 h取樣測(cè)定菌體在生長(zhǎng)過(guò)程中葡萄糖質(zhì)量濃度的變化。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)篩選得到的對(duì)植物乳桿菌NDC 75017生長(zhǎng)有顯著影響的因素：葡萄糖、牛肉膏、酵母粉、胰蛋白胨、檸檬酸氫二銨、乙酸銨、乙酸鈉、Tween 80、硫酸鎂和硫酸錳10個(gè)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)因素取2個(gè)水平，高水平(+1)為低水平(-1)的1.5倍，以植物乳桿菌的菌體濃度為響應(yīng)值[13]。

1.4.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選得到的影響菌體濃度的顯著影響因素確定最陡爬坡試驗(yàn)的方向和梯度，確定試驗(yàn)因素的中心點(diǎn)。

1.4.3 Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)1.4.1和1.4.2確定的試驗(yàn)因素和中心點(diǎn)，采用Design-Expert軟件進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)，將得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到一個(gè)響應(yīng)變量與自變量之間的模型。根據(jù)建立的模型計(jì)算得到植物乳桿菌NDC 75017最佳增殖培養(yǎng)基配方。

1.4.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

將活化好的種子液按2%的比例分別接種至普通MRS培養(yǎng)基和1.4.3響應(yīng)面設(shè)計(jì)的增值培養(yǎng)基中，30℃ 靜置培養(yǎng)。每隔2 h取樣測(cè)定發(fā)酵液的活菌數(shù)及干重。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)過(guò)程每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行。采用Design Expert 17.0設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析；采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性差異分析；數(shù)據(jù)計(jì)算、繪圖采用Microsoft Excel 2003軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌NDC 75017的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

植物乳桿菌NDC 75017的生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖 1所示。由圖1可以看出，菌體生長(zhǎng)至12 h時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期，此時(shí)活菌數(shù)最高達(dá)到6.48×1010mL-1；菌體整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中，發(fā)酵液中的pH值從5.8下降到3.4，葡糖的質(zhì)量濃度從16.6 g/L下降到1.2 g/L。另外，從圖中可以明顯看出，當(dāng)菌體生長(zhǎng)到18 h時(shí)活菌數(shù)迅速下降，可能原因是由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如碳源的消耗和pH值的下降(主要是菌體代謝葡萄糖產(chǎn)生乳酸造成的)造成菌體活力下降，并出現(xiàn)菌體自溶現(xiàn)象[5]。

圖1 植物乳桿菌NDC 75017的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.2 碳源、氮源、緩沖鹽、生長(zhǎng)因子及培養(yǎng)條的篩選

由圖2～圖5可以看出，對(duì)植物乳桿菌NDC 75017有明顯促進(jìn)作用的碳源為葡萄糖，氮源為酵母粉、牛肉膏和胰蛋白胨，緩沖鹽為檸檬酸氫二銨和乙酸銨，生長(zhǎng)因子為硫酸錳、硫酸鎂和Tween 80。有研究者研究證明復(fù)合氮源比單一氮源更有利于乳酸菌的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)選用酵母粉、牛肉膏和胰蛋白胨為植物乳桿菌NDC75017生長(zhǎng)的復(fù)合氮源[12]。

圖2 碳源對(duì)L.p NDC 75017生長(zhǎng)的影響

2.3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選因素編碼及水平如表1和表2所示。由表1和表2可以看出，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案下植物乳桿菌NDC 75017活菌數(shù)的變化。表3是根據(jù)表2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程選取的每個(gè)實(shí)驗(yàn)因素效應(yīng)大小進(jìn)行分析的結(jié)果。

圖3 氮源對(duì)L.p NDC75017生長(zhǎng)的影響

圖4 緩沖鹽對(duì)L.p NDC75017生長(zhǎng)的影響

圖5 生長(zhǎng)因子對(duì)L.p NDC 75017生長(zhǎng)的影響

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選各因素及水平

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素對(duì)NDC 75017細(xì)胞活菌數(shù)的影響

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析表

由表3可以看出，X1(葡萄糖)、X6(乙酸銨)2個(gè)因素的效應(yīng)為負(fù)，表明因素X1(葡萄糖)、X6(乙酸銨)對(duì)菌體濃度的影響為負(fù)效應(yīng)，即隨著培養(yǎng)基中葡萄糖、乙酸銨含量的增加，活菌數(shù)呈下降趨勢(shì)；其余因素的效應(yīng)為正，均為正效應(yīng)。其中葡萄糖、檸檬酸氫二銨、乙酸銨和硫酸錳的P值均小于0.05，表明這三個(gè)因素對(duì)活菌數(shù)的影響顯著。而檸檬酸氫二銨、乙酸銨在菌體生長(zhǎng)過(guò)程中均起到緩沖鹽的作用，為了后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方便，這里只選取檸檬酸氫二銨作為培養(yǎng)基中的緩沖鹽。故采用葡萄糖、檸檬酸氫二銨和硫酸錳這3個(gè)因素為主要研究對(duì)象做后續(xù)研究，利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定三個(gè)因素的最佳濃度范圍。

2.4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選得到的顯著影響因素的效應(yīng)大小確定最陡爬坡試驗(yàn)的方向和梯度(見(jiàn)表4)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素的中心點(diǎn)。

由表4可以看出，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度降低，檸檬酸氫二銨和硫酸錳濃度的升高，活菌數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，活菌最高的響應(yīng)值區(qū)域在第四組實(shí)驗(yàn)。故響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素的中心點(diǎn)為葡萄糖15 g/L，檸檬酸氫二銨3.5 g/L，硫酸錳0.4 g/L。

表4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.5 Box-Behnken Design響應(yīng)面設(shè)計(jì)

根據(jù)2.3和2.4實(shí)驗(yàn)篩選得到的對(duì)菌體生長(zhǎng)有顯著影響的因素葡萄糖、檸檬酸氫二銨、硫酸錳和由最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定的試驗(yàn)因素中心點(diǎn)，采用Design Expert 17.0軟件進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)。表5是以葡萄糖、檸檬酸氫二銨、硫酸錳3個(gè)因素為自變量，植物乳桿菌NDC75017活菌數(shù)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方案。表6是根據(jù)表5設(shè)計(jì)方案得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

表5 Box-Behnken Design因素

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)表6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)Design-Expert 17.0軟件處理確定回歸方程：Y=6.65+0.39X1+0.013X2+0.19X3+0.11X1X2-0.100X1X3+0.0073X2X3-0.77X12-0.43X22-0.44X32，

式中：Y為植物乳桿菌NDC 75017菌體濃度的預(yù)測(cè)響應(yīng)值；X1為葡萄糖的編碼值；X2為檸檬酸氫二銨的編碼值；X3為硫酸錳的編碼值。回歸方程方差分析如表7所示。

表7 響應(yīng)面二次方模型方差分析

由表7可以看出，經(jīng)Design-Expert 17.0軟件分析，所建立的模型Prob＞F值為0.0012小于0.01表明建立的模型影響極顯著；模型失擬項(xiàng)Prob＞F為0.0632，大于0.05，即失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明本試驗(yàn)建立的模型在整個(gè)回歸區(qū)域的擬合度較好，接近真實(shí)的響應(yīng)曲面情況，模型建立合理；CV(變異系數(shù))表示模型的精確度，本研究模型中CV=3.83%，較低，說(shuō)明模型精確度高，結(jié)果可信。模型的決定系數(shù)R2=94.51%，矯正系數(shù)RAdj2=87.46%，表明預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間具有高度相關(guān)性，能解釋87.46%的響應(yīng)值變化，故可以利用此模型代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)植物乳桿菌NDC 75017的菌體濃度進(jìn)行預(yù)測(cè)。

圖6 響應(yīng)面立體圖

從響應(yīng)面分析可知，回歸模型存在最大值。根據(jù)Design-Expert 17.0軟件得到的回歸方程可計(jì)算得到Y(jié)的最大估計(jì)值為6.72×1010mL-1，此時(shí)葡萄糖16.31 g/L、檸檬酸氫二銨3.52 g/L，硫酸錳0.41 g/L。

2.5 優(yōu)化條件的驗(yàn)證

圖7為優(yōu)化前后細(xì)胞生物量的變化，經(jīng)優(yōu)化后細(xì)胞干重由原來(lái)的3.31 g/L提高到3.93 g/L，細(xì)胞干重提高了原來(lái)的1.2倍。圖8為優(yōu)化前后細(xì)胞活菌數(shù)的變化，經(jīng)優(yōu)化后，最大活菌數(shù)由原來(lái)的3.15×1010mL-1提高到6.48×1010mL-1，活菌數(shù)提高了2.1倍。且活菌數(shù)與響應(yīng)面預(yù)測(cè)的最大活菌數(shù)6.72×1010mL-1接近。說(shuō)明回歸方程能夠真實(shí)的反映篩選因素對(duì)植物乳桿菌NDC 75017生長(zhǎng)的影響，對(duì)于培養(yǎng)基的優(yōu)化研究具有指導(dǎo)意義。

圖7 優(yōu)化前后細(xì)胞干重的變化

圖8 優(yōu)化前后細(xì)胞活菌數(shù)的變化

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)通過(guò)Plackett-Burman法、最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)植物乳桿菌培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化。確定了植物乳桿菌增值的培養(yǎng)基配方為：葡萄糖16.31 g/L，酵母粉7.5 g/L，胰蛋白胨15 g/L，牛肉膏7.5 g/L，檸檬酸氫二銨3.52 g/L，乙酸銨5 g/L，乙酸鈉5 g/L，Tween80 1.5 mL/L，硫酸鎂0.87 g/L，硫酸錳0.41 g/L。最大活菌數(shù)由原來(lái)的3.15×1010mL-1提高到6.48×1010mL-1，活菌數(shù)提高了2.1倍；細(xì)胞干重由原來(lái)的3.31 g/L提高到3.93 g/L，細(xì)胞干重提高了原來(lái)的1.2倍。在增殖培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上對(duì)植物乳桿菌NDC 75017利用發(fā)酵罐進(jìn)行高密度培養(yǎng)并制備高活性乳酸菌發(fā)酵劑將是后續(xù)研究。

[1]REZA M.The starter culture characteristics of probiotic microorganismsin fermented milks[J].Wiley-VCH Verlag GmbH.2012,12:1-11.

[2]ATHANASIOS A K,HARRIS P.Whey valorisation:A complete and novel technology development for dairy industry starter culture production[J].Bioresource Technology，2009,100:3734-3739.

[3]CHRISTOPHE L，SELCUK Y.Fermentation technologies for the production of probiotics with viability and functionality [J].Current Opinion in Biotechnology，2007,18:176-183.

[4]WICHITTRA B,KENJI S.Single step lactic acid production from cassava starch by lactobacillus plantarum SW14 in conventional continuous and continuous with high cell density [J].APCBEE Procadia，2012(2):97-103.

[5]XIONG T,HUANG X H.High-density cultivation of Lactobacillus plantarum NCU116 in an ammonium and glucose fed-batch system[J].African Journal of Biotechnology，2011,10(38):7518-7525.

[6]RIESENBERG D,GUTHKE R.High-cell-density cultivation of microorganisms[J].Appl Microbiol Biotechnol,，1999,51:422-430.

[7]郭本恒，益生菌 [M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004：415-422.

[8]YAN T,MAN C,SHAN Y,et al.Production and sensory evaluation of high γ-aminobutyric acid-enriched fermented milk by lactobacillus plantarum[J].Journal of Dairy Science，2013:96(suppl.1):310-311.

[9]姜毓君，單藝，滿(mǎn)朝新，等.一種具有高產(chǎn)γ-氨基丁酸能力的菌株[P].專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺?01110439694.5.

[10]王今雨，滿(mǎn)朝新，楊相宜，等.植物乳桿菌NDC75017降膽固醇作用的研究[J].食品科學(xué)，2013,34(3)：243-247.

[11]劉穎，滿(mǎn)朝新，呂學(xué)娜，等.植物乳桿菌NDC75017作用Caco-2細(xì)胞后對(duì)IL6表達(dá)的影響[J].微生物學(xué)報(bào)，2012，52(10):1237-1243.

[12]VINODH A E,MELANIE H.Biomass production and small-scale testing of freeze-dried Lactic acid bacteria starter strains for cassava fermentations[J].Food Control，2011,22:389-395.

[13]NADIA A S,MAHMOUD M B.Polyglutamic acid(PGA)production by Bacillussp.SAB-26:application of Plackett-Burman experimental design to evaluate culture requirements[J].Biotechnological products and process engineering，2005,69:259-267.