薛曉麗等

摘要：優(yōu)化從貫葉連翹粗提取物中提取金絲桃素的工藝條件。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法，以金絲桃素的提取率為響應(yīng)值，通過回歸分析各工藝參數(shù)與響應(yīng)值之間的關(guān)系，預(yù)測最佳提取工藝條件。結(jié)果表明：金絲桃素最佳提取條件為：浸提溫度80 ℃，浸提時間 105 min，液料比 75 mL ∶1 g，甲醇體積分?jǐn)?shù)85%，比條件下提取率為 372%。驗(yàn)證試驗(yàn)證明此法合理高效，預(yù)測準(zhǔn)確，方便可行。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)曲面法；金絲桃素；提?。还に嚄l件優(yōu)化

中圖分類號： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0221-03

收稿日期：2013-08-27

基金項(xiàng)目：長白山動植物資源利用與保護(hù)吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2012年一般基金（編號：吉農(nóng)院合字[2012]第706號）。

作者簡介：薛曉麗（1970—），女，吉林永吉人，碩士，高級實(shí)驗(yàn)師，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)的教學(xué)與科研工作。E-mail：lilyxue4222@hotmail.com。金絲桃素屬駢苯二蒽酮類物質(zhì)，分子式C30H16O8，廣泛分布于貫葉金絲桃（Hypericum perforatum）、烏腺金絲桃（H. attenuatum）、長柱金絲桃（H. ascyron）等植物中。近年來，金絲桃素在抗腫瘤的光化學(xué)治療、抗病毒（包括HIV）、抗抑郁機(jī)制研究等方面十分活躍。已有研究表明，金絲桃素作為有效的光敏劑，通過光動力學(xué)治療可以有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，臨床上已用于治療基體細(xì)胞癌、胰腺癌、膀胱癌甚至腦瘤等[1-4]。另外，近年來大量試驗(yàn)已證明，金絲桃素為廣譜抗病毒的中草藥活性單體，對多種畜禽傳染病有良好防治效果。已有不少文獻(xiàn)報(bào)道了用金絲桃素防治豬高熱病、雞新城疫、鴨病毒性肝炎等[5-9]的事例，使其成為繼紅豆杉、人參和銀杏葉之后，國內(nèi)外研究的又一個熱點(diǎn)，在新藥開發(fā)上具有重大意義[10]。金絲桃素具有特殊理化性質(zhì)及其在光和熱的作用下易分解、易氧化變質(zhì)的特性，故其提取率和產(chǎn)品純度都較低，制約了其深入研究和制藥工藝的發(fā)展。本試驗(yàn)以甲醇為溶劑，采用易于工業(yè)化生產(chǎn)的熱浸提取方法，以金絲桃素提取率為考察指標(biāo)，以提取時間、液固比、提取溫度、甲醇體積分?jǐn)?shù)為提取工藝的主要影響因素，通過單因素試驗(yàn)確定影響較大的3個因素，采用響應(yīng)曲面法（response surface methodology）進(jìn)行優(yōu)化，確定從貫葉連翹粗提物中提取金絲桃素的最佳工藝。響應(yīng)曲面法是目前廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物中有效化學(xué)成分提取工藝優(yōu)化的一種數(shù)據(jù)處理方法[11-13]，具有簡便、試驗(yàn)精度高的優(yōu)點(diǎn)，使用該方法優(yōu)化后的的金絲桃素提取率有明顯的提高，為金絲桃素提取的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

供試材料為貫葉連翹粗粉，購于西安康培基生物科技有限公司。材料陰干至恒重，備用。金絲桃素對照品，購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，純度>98%。

試劑包括甲醇、石油醚，均購于天津永大化學(xué)試劑有限公司，去離子水由實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2儀器

紫外分光光度計(jì)（島津 UV-2450）；恒溫水浴鍋（金壇醫(yī)療儀器廠HH-S4）；分析天平（梅特勒 AL204）；超純水機(jī)（密理博-Q3）等。

1.3方法

1.3.1金絲桃素提取將貫葉連翹粗粉陰干樣品過20目篩，用石油醚在55 ℃脫脂3 次，干燥備用。精確稱取一定量樣品，加入到一定量、一定體積分?jǐn)?shù)的甲醇溶液中，置于一定溫度的水浴鍋中，浸提一定時間后，離心，定容。將提取液稀釋10倍后，置紫外分光光度計(jì)中590 nm下檢測吸光度。每個試驗(yàn)3次平行，取平均值，結(jié)果以提取率（E）表示。E=[（C×V）/m]×f×100%，式中：C為金絲桃素的質(zhì)量濃度（μg/mL）；V為加入溶劑的體積（mL）；m為樣品的質(zhì)量（g）；f為稀釋倍數(shù)。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精確稱取金絲桃素對照品5.1 mg，加入到甲醇定容至25 mL的容量瓶中，搖勻，配成質(zhì)量濃度為0.204 mg/mL的對照品溶液，將此溶液稀釋10倍后做為標(biāo)準(zhǔn)母液。準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)母液，定容至10 mL容量瓶中，配成濃度為1.280～20.40 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。置紫外分光光度計(jì)中590 nm下檢測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸曲線y=0.599 2x+0.248 7，r2=0.999 9。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1液固比對金絲桃素提取率的影響在溫度80 ℃、甲醇體積分?jǐn)?shù)85%、提取時間110 min的條件下，考察液固比25 ∶1～125 ∶1（mL/g）對提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

2.1.2提取溫度對金絲桃素提取率影響在液固比 75 mL ∶1 g、甲醇體積分?jǐn)?shù)85%、提取時間110 min的條件下，考察提取溫度60、70、75、80、85 ℃對金絲桃素提取率的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，在80 ℃之前，隨溫度的升高，金絲桃素提取率不斷增加，在80 ℃時提取率達(dá)到最大；80 ℃ 后提取率迅速下降。主要是由于溫度過高，金絲桃素迅速分解，使提取率大大下降，因此選擇提取溫度為80 ℃。

2.1.3提取時間對金絲桃素提取率的影響在液固比 75 mL ∶1 g、提取溫度80 ℃、甲醇體積分?jǐn)?shù)85%的條件下，考察提取時間50、70、90、110、130 min對金絲桃素提取率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，金絲桃素提取率隨提取時間延長而逐漸增加，在提取110 min時達(dá)到最大值，隨后減小。這可能是由于提取時間過長，金絲桃素有部分分解，另外一些糖類和蛋白質(zhì)雜質(zhì)慢慢溶出，使得溶液黏度增大，金絲桃素被吸附在固體基質(zhì)上而不易被提取出來。因此應(yīng)選擇 110 min 作為最佳的提取時間。endprint

2.1.4甲醇體積分?jǐn)?shù)對金絲桃素提取率的影響在液固比 75 mL∶1 g、提取時間110 min、提取溫度80 ℃的條件下，考察甲醇體積分?jǐn)?shù)70%、75%、80%、85%、90%、95%對提取率的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，金絲桃素在甲醇體積分?jǐn)?shù)85%時提取率最高。主要與樣品中有很多極性不同的化合物有關(guān)，不同化合物最適合的溶劑極性各不相同。因此，金絲桃素提取率會隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加先增大后減小，因此，甲醇體積分?jǐn)?shù)以85%為最佳。

2.2響應(yīng)曲面法優(yōu)化金絲桃素的提取工藝

2.2.1響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果為優(yōu)化金絲桃素的提取工藝條件，采用經(jīng)典的3因素3水平 Box-Behnken Design（BBD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，精確稱取 0.200 g 貫葉連翹粗提物于具塞塑料管中，選取對金絲桃素提取率有較大影響的提取時間（A）、提取溫度（B）、甲醇體積分?jǐn)?shù)（C）3因素進(jìn)行優(yōu)化。具體方案及結(jié)果見表1、表2。

2.2.3響應(yīng)曲面分析由圖5可以看出，提取率隨提取溫度的變化幅度較大，其次是提取時間變化對提取率的影響，而甲醇體積分?jǐn)?shù)的變化對提取率的影響幅度較平緩?？梢?，提取溫度對提取率的影響最為顯著。通過優(yōu)化分析，最佳的提取條件為：提取溫度78.8 ℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)87.5%，提取時間103.78 min，液固比75 mL ∶1 g，預(yù)測金絲桃素提取率為372%。但考慮到實(shí)際操作的局限性，將金絲桃素的提取工藝修正為：提取溫度80 ℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)90%，提取時間 105 min，液固比75 mL ∶1 g。在此條件下提取3次，金絲桃素的平均提取率為3.714%，與預(yù)測值基本相符，證實(shí)了該方程的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

3結(jié)論

采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)曲面法對金絲桃素提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，通過回歸分析建立相關(guān)性良好的方程，得到的最佳的提取工藝為：提取溫度80 ℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)90%，提取時間105 min，液固比75 mL ∶1 g。試驗(yàn)值與預(yù)測值相符，證實(shí)該方程的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

需要注意的是，在配制金絲桃素標(biāo)準(zhǔn)溶液時應(yīng)注意其不易溶及見光易分解的問題，操作時要求操作者能熟練掌握儀器的使用及藥品的配制。

參考文獻(xiàn)：

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[13]胡成旭，侯欣彤，馮永寧，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化云芝多糖提取條件的研究[J]. 食品工業(yè)科技，2007，7（7）：124-126，130.endprint

2.1.4甲醇體積分?jǐn)?shù)對金絲桃素提取率的影響在液固比 75 mL∶1 g、提取時間110 min、提取溫度80 ℃的條件下，考察甲醇體積分?jǐn)?shù)70%、75%、80%、85%、90%、95%對提取率的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，金絲桃素在甲醇體積分?jǐn)?shù)85%時提取率最高。主要與樣品中有很多極性不同的化合物有關(guān)，不同化合物最適合的溶劑極性各不相同。因此，金絲桃素提取率會隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加先增大后減小，因此，甲醇體積分?jǐn)?shù)以85%為最佳。

2.2響應(yīng)曲面法優(yōu)化金絲桃素的提取工藝

2.2.1響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果為優(yōu)化金絲桃素的提取工藝條件，采用經(jīng)典的3因素3水平 Box-Behnken Design（BBD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，精確稱取 0.200 g 貫葉連翹粗提物于具塞塑料管中，選取對金絲桃素提取率有較大影響的提取時間（A）、提取溫度（B）、甲醇體積分?jǐn)?shù)（C）3因素進(jìn)行優(yōu)化。具體方案及結(jié)果見表1、表2。

2.2.3響應(yīng)曲面分析由圖5可以看出，提取率隨提取溫度的變化幅度較大，其次是提取時間變化對提取率的影響，而甲醇體積分?jǐn)?shù)的變化對提取率的影響幅度較平緩。可見，提取溫度對提取率的影響最為顯著。通過優(yōu)化分析，最佳的提取條件為：提取溫度78.8 ℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)87.5%，提取時間103.78 min，液固比75 mL ∶1 g，預(yù)測金絲桃素提取率為372%。但考慮到實(shí)際操作的局限性，將金絲桃素的提取工藝修正為：提取溫度80 ℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)90%，提取時間 105 min，液固比75 mL ∶1 g。在此條件下提取3次，金絲桃素的平均提取率為3.714%，與預(yù)測值基本相符，證實(shí)了該方程的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

3結(jié)論

采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)曲面法對金絲桃素提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，通過回歸分析建立相關(guān)性良好的方程，得到的最佳的提取工藝為：提取溫度80 ℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)90%，提取時間105 min，液固比75 mL ∶1 g。試驗(yàn)值與預(yù)測值相符，證實(shí)該方程的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

需要注意的是，在配制金絲桃素標(biāo)準(zhǔn)溶液時應(yīng)注意其不易溶及見光易分解的問題，操作時要求操作者能熟練掌握儀器的使用及藥品的配制。

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2.1.4甲醇體積分?jǐn)?shù)對金絲桃素提取率的影響在液固比 75 mL∶1 g、提取時間110 min、提取溫度80 ℃的條件下，考察甲醇體積分?jǐn)?shù)70%、75%、80%、85%、90%、95%對提取率的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，金絲桃素在甲醇體積分?jǐn)?shù)85%時提取率最高。主要與樣品中有很多極性不同的化合物有關(guān)，不同化合物最適合的溶劑極性各不相同。因此，金絲桃素提取率會隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加先增大后減小，因此，甲醇體積分?jǐn)?shù)以85%為最佳。

2.2響應(yīng)曲面法優(yōu)化金絲桃素的提取工藝

2.2.1響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果為優(yōu)化金絲桃素的提取工藝條件，采用經(jīng)典的3因素3水平 Box-Behnken Design（BBD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，精確稱取 0.200 g 貫葉連翹粗提物于具塞塑料管中，選取對金絲桃素提取率有較大影響的提取時間（A）、提取溫度（B）、甲醇體積分?jǐn)?shù)（C）3因素進(jìn)行優(yōu)化。具體方案及結(jié)果見表1、表2。

2.2.3響應(yīng)曲面分析由圖5可以看出，提取率隨提取溫度的變化幅度較大，其次是提取時間變化對提取率的影響，而甲醇體積分?jǐn)?shù)的變化對提取率的影響幅度較平緩?？梢姡崛囟葘μ崛÷实挠绊懽顬轱@著。通過優(yōu)化分析，最佳的提取條件為：提取溫度78.8 ℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)87.5%，提取時間103.78 min，液固比75 mL ∶1 g，預(yù)測金絲桃素提取率為372%。但考慮到實(shí)際操作的局限性，將金絲桃素的提取工藝修正為：提取溫度80 ℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)90%，提取時間 105 min，液固比75 mL ∶1 g。在此條件下提取3次，金絲桃素的平均提取率為3.714%，與預(yù)測值基本相符，證實(shí)了該方程的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

3結(jié)論

采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)曲面法對金絲桃素提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，通過回歸分析建立相關(guān)性良好的方程，得到的最佳的提取工藝為：提取溫度80 ℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)90%，提取時間105 min，液固比75 mL ∶1 g。試驗(yàn)值與預(yù)測值相符，證實(shí)該方程的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

需要注意的是，在配制金絲桃素標(biāo)準(zhǔn)溶液時應(yīng)注意其不易溶及見光易分解的問題，操作時要求操作者能熟練掌握儀器的使用及藥品的配制。

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