楊曉蕊，徐 婧，馬麗娜，郭 明

（大連大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116622）

自2007 年玫瑰寵物食品中毒事件[1]和2008 年三鹿嬰幼兒奶粉事件[2]等食品安全問題后，三聚氰胺（Melamine, C3H6N6）的危害引起人們的廣泛關(guān)注。人體攝入三聚氰胺將導(dǎo)致生殖、泌尿系統(tǒng)疾病，如腎結(jié)石、膀胱癌等[2]。目前，檢測三聚氰胺的方法主要有：電位滴定法[3]，毛細管電泳[4-5]，高效液相色譜法[6]，高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[7]，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8]，高效液相色譜-紫外法[9]，高效液相色譜-二極管陣列法[10]及其他電化學(xué)檢測方法[11-15]等。但這些方法儀器設(shè)備較復(fù)雜，移動不方便，現(xiàn)場應(yīng)用較難。電化學(xué)工作站作為一種操作簡便、分析成本低的儀器[16]，對三聚氰胺的檢測具有良好的應(yīng)用前景。目前，以電化學(xué)法檢測三聚氰胺的應(yīng)用已有報道。張義根等[17]使用溶膠-凝膠分子印跡技術(shù)，以電化學(xué)分析法檢測了三聚氰胺，線性范圍為1.0×10-7~1.0×10-3mol/L。金根娣等[18]用裸玻碳工作電極，以電化學(xué)法建立測定牛奶中三聚氰胺的方法，線性范圍和檢出限分別為15~345 mg/kg 和5 mg/kg。

石墨烯(Graphene, GR)作為目前發(fā)現(xiàn)的最薄的二維材料，碳原子緊密堆積形成單層二維蜂窩狀晶格結(jié)構(gòu)，具有良好的導(dǎo)電性[19-20]。石墨烯制備簡單、成本低、具有獨特的超導(dǎo)性能以及新型的量子霍爾效應(yīng)[21-23]等優(yōu)點，已應(yīng)用于雙酚A[24-26]、抗壞血酸[27]、蘇丹紅[28]、咖啡因[29]、克倫特羅[30-31]等樣品的檢測。本文將石墨烯分散于殼聚糖（Chitosan, CTS）中修飾于玻碳電極（Glassy Carbon Electrode, GCE）表面，以石墨烯-殼聚糖修飾電極（CTS/GR/GCE），分析研究了三聚氰胺在CTS/GR/GCE 上的電化學(xué)行為，對于實際樣品的定性和定量檢測效果明顯，可用于實際樣品檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI600C 電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司）、CS300 電化學(xué)工作站(武漢科斯特儀器公司）、（三電極系統(tǒng)：玻碳電極GC 為工作電極，Ag/AgCl 為參比電極，鉑電極為對電極）、KQ-100DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、Mettler Toledo PL 203 電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、掃描電子顯微鏡（HITACHI S-4800）

三聚氰胺、殼聚糖（配制成0.3 g/L 殼聚糖乙酸溶液）等試劑均為分析純。

1.2 石墨烯殼聚糖電極的制備

1.2.1 玻碳電極（GC）預(yù)處理

先將玻碳電極在金相砂紙上打磨，接著分別以粒徑為1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm 的Al2O3拋光粉在濕潤的麂皮上拋光打磨成鏡面，然后依次用去離子水、HNO3（濃HNO3:水＝1:1，V/V）、無水乙醇、去離子水在超聲波清洗器中清洗10 min。為增加電極表面電活性點的濃度，將電極在0.5 mol /L H2SO4中活化，直到得到穩(wěn)定的伏安曲線。

1.2.2 石墨烯-殼聚糖修飾電極（CTS/GR/GCE 電極）的制備

采用Hummers 法[25]將石墨粉制備得到氧化石墨烯，對制得的氧化石墨烯進行還原，得到石墨烯粉末。圖1 為掃描電子顯微鏡（SEM）對合成的石墨烯進行的分析測試。由圖可見，合成的石墨烯為片層結(jié)構(gòu)，邊緣少量褶皺為石墨烯聚集的結(jié)果。

圖1 石墨烯的掃描電子顯微鏡

配制25 mL 石墨烯-殼聚糖修飾液：取1.5 g/L 石墨烯溶液與0.3 g/L 殼聚糖乙酸以體積比為1:2 混合，超聲使其分散均勻，即可得到石墨烯濃度為0.5 g/L石墨烯-殼聚糖修飾液。

移取5μL 0.5 g/L 石墨烯-殼聚糖修飾液于GCE表面，紅外燈下烘干30 min 得到灰黑色修飾膜，冷卻后即得石墨烯-殼聚糖修飾電極（CTS/GR/GCE 電極）。

1.3 牛奶中三聚氰胺的測定方法

移取5 mL 牛奶加水稀釋至25 mL，加三聚氰胺標準溶液，攪拌均勻。再以2 mol /L H2SO4為溶劑稀釋到50 mL，攪拌均勻，靜置5 min。由于牛奶中的蛋白質(zhì)遇稀硫酸變質(zhì)凝固為白色絮狀沉淀，固本實驗采用常規(guī)過濾方法，用化學(xué)分析濾紙與漏斗過濾，所得到的濾出液以修飾好的CTS/GR/GCE 電極進行循環(huán)伏安法研究。

2 結(jié)果與討論

2.1 石墨烯分散劑的選擇

本實驗選擇了幾種石墨烯的分散劑，如水、石蠟、聚乙二醇等，最后發(fā)現(xiàn)殼聚糖效果較好，圖2 為采用差分脈沖法（DPV）以H2O、殼聚糖為石墨烯的分散劑對比裸玻碳電極（GCE），以1 mol /L H2SO4為溶劑，檢測1×10-4mol /L 三聚氰胺溶液的實驗結(jié)果。實驗中采用的電壓范圍為0～1.5 V，振幅為0.05，電位增量為0.004 V，脈沖寬度為0.05 s，脈沖周期為0.2 s，采樣間隔為0.001 s。 由圖2 可知：與GCE 相比，在0.5 V 附近，三聚氰胺在以殼聚糖為石墨烯分散劑修飾電極（CTS/GR/GCE 電極）上的電流相應(yīng)信號最大，特征峰值最大，說明CTS/GR/GCE 電極對三聚氰胺具有較好的電催化效應(yīng)。這是由于石墨烯具有的獨特納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)加大了玻碳電極的比表面積，使得三聚氰胺在CTS/GR/GCE 電極上的電流相應(yīng)信號增大，反應(yīng)活性明顯增強[32]。故本實驗選取殼聚糖為石墨烯的分散劑。

圖2 石墨烯分散劑的差分脈沖（DPV）對比圖

2.2 三聚氰胺在石墨烯殼聚糖電極上的電化學(xué)行為

本實驗以修飾好的CTS/GR/GCE 電極為工作電極，Ag/AgCl 參比電極、鉑電極對電極進行循環(huán)伏安法研究。經(jīng)過多次實驗，選取了三聚氰胺的最佳測定條件：以1 mol/L H2SO4為溶劑，掃描電壓范圍為0～1.9 V，掃描速度為100 mV/s，檢測1×10-3mol/L 三聚氰胺溶液。實驗結(jié)果見圖3，結(jié)果表明：在0.8 V和0.765 V 處出現(xiàn)一對明顯的氧化還原峰。由于這對特征峰的峰電流值與三聚氰胺的濃度呈正比關(guān)系，故可以對三聚氰胺待測液進行定性定量檢測。

圖3 三聚氰胺在CTS/GR/GCE 電極上的循環(huán)伏安圖

2.3 溶劑的選擇

實驗中分別選取了H2O、pH=4.0 的HAc-NaAc、pH=7.5 的PBS、10%三氯乙酸、1 mol /L 的H2SO4等為三聚氰胺的溶劑，在電壓范圍為0～1.9 V，掃描速度為100 mV/s 時，采用循環(huán)伏安法掃描含三聚氰胺溶液。實驗結(jié)果表明，以1 mol /L H2SO4為三聚氰胺的溶劑時，三聚氰胺在0.8 V 附近出現(xiàn)一對明顯的氧化還原峰，而選用其他溶劑時，峰型及峰電流較差。說明酸度為該氧化還原過程關(guān)鍵，故本實驗選取1 mol /L H2SO4為測定三聚氰胺的溶劑。

2.4 掃描速率與掃描時間

為獲得最佳的測定結(jié)果，采用修飾好的CTS/GR/GCE 電極分別在1 mol /L H2SO4為溶劑、對1×10-3mol /L 三聚氰胺溶液進行測定，重點考察了掃描速率和掃描時間兩個參數(shù)。實驗結(jié)果表明，掃描速率在50～500 mV/s 時，三聚氰胺在CTS/GR/GCE 電極上反應(yīng)受吸附控制。當v＞100 mV/s，吸附時間隨掃描速率的增大而減小，峰形逐漸變差，且掃描速率較大時靈敏度會降低，故為減少實驗時間增加實驗靈敏度，本實驗選擇100 mV/s 作為掃描速度。

本實驗還考察了不同掃描圈數(shù)對三聚氰胺峰電流的影響。實驗結(jié)果表明：平均100 圈后，三聚氰胺開始在CTS/GR/GCE 電極上吸附，出現(xiàn)氧化還原峰。但隨著掃描圈數(shù)的增加，峰電流值的增加緩慢，為節(jié)省實驗時間，本實驗中掃描圈數(shù)最多為150 圈。

2.5 線性范圍及檢出限

如圖4 所示，以循環(huán)伏安法在最佳測定條件下測定時，不同濃度的三聚氰胺與一對氧化還原峰之間符合線性關(guān)系。經(jīng)測定：三聚氰胺的線性檢測范圍為5×10-3～5×10-5mol/L，氧化峰與三聚氰胺濃度的線性回歸方程為I=0.0035 C+9×10-6，相關(guān)系數(shù)R= 0.9917；還原峰與三聚氰胺濃度的線性回歸方程為I=-0.0005 C-5×10-6，相關(guān)系數(shù)R=0.9938。在該檢測條件下，檢出限為1×10-5mol/L。

圖4 不同濃度三聚氰胺在CTS/GR/GCE 電極上的循環(huán)伏安圖

曲線1~8 分別為三聚氰胺濃度5×10-3、2×10-3、1×10-3、6×10-4、2×10-4、1×10-4、8×10-5、5×10-5mol/ L；右下角圖為氧化峰、還原峰與三聚氰胺濃度的標準曲線圖。

2.6 重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

在最佳測定條件下，以同一根修飾好的CTS/GR/GCE 電極分別測定1×10-3mol/L 三聚氰胺樣品溶液，重復(fù)測定6 次，峰電流分別為1.29×10-5A，

1.30×10-5A，1.29×10-5A，1.26×10-5A，1.28×10-5A，1.31×10-5A，平均峰電流為1.288×10-5A，相對標準偏差RSD 為1.23 %，表明該電極具有良好的重現(xiàn)性。

2.7 電極穩(wěn)定性實驗

將該電極室溫放置48 h 后重復(fù)上述實驗，結(jié)果表明，峰電流略有下降，峰電流為1.16×10-5A，約為上述實驗測定值的90.1 %，表明該電極具有良好的穩(wěn)定性。

2.8 干擾實驗

在最佳測定條件下，在1×10-3mol /L 三聚氰胺溶液中，分別加入常見無機鹽和有機化合物，研究其對三聚氰胺的干擾情況。實驗結(jié)果表明：500 倍的常見無機鹽NaCl、KNO3，100 倍的葡萄糖、牛血清白蛋白（BSA）和尿素等均不干擾三聚氰胺的檢測。由此可見，該方法具有良好的選擇性，可以有效地應(yīng)用于實際樣品的檢測。

2.9 樣品的測定

選取市場上銷售的某兩種知名品牌的牛奶，以實驗方法1.3 進行研究，實驗結(jié)果見表1。實驗結(jié)果表明，該方法對實際樣品的檢測效果明顯，加標回收率為93%～101%。

表1 樣品中三聚氰胺含量的測定（n=3）

3 結(jié)語

利用石墨烯-殼聚糖修飾電極（CTS/GR/GCE 電極）構(gòu)建了一種檢測牛奶中三聚氰胺的新方法。三聚氰胺的線性檢測范圍為5×10-3～5×10-5mol/L，檢出限為1×10-5mol/L，相對標準偏差RSD 為1.23%。該方法準確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，在實際樣品的檢測中具有良好的應(yīng)用前景。

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