張瓊++王莉莉++楊利

【摘要】 目的：建立1株耐STI571的K562細(xì)胞，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究分析，探討耐藥機(jī)理。方法：通過遞增STI571藥物濃度的方法，成功建立1株耐STI571人白血病細(xì)胞株K562/R，并采用RT-PCR、Western-blot、免疫組化、基因測序等生物學(xué)手段對其進(jìn)行耐藥機(jī)理進(jìn)行分析。結(jié)果：K562/R細(xì)胞株在STI571濃度高達(dá)1 μmol/L水平，仍能穩(wěn)定生長，繁殖旺盛。K562/R細(xì)胞株耐STI57程度較親代K562細(xì)胞多達(dá)235倍，該耐藥細(xì)胞株對HHT﹑VCR﹑DNR具有不同程度的交叉耐藥性，與親代K562細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與親代敏感株K562細(xì)胞相比，其BCR-ABL基因表達(dá)上調(diào)，BCR-ABL蛋白及其激酶過度表達(dá)。結(jié)論：成功建立耐STI571人白血病細(xì)胞株K562/R，并對其生物學(xué)特性的研究，為STI571耐藥機(jī)制的進(jìn)一步深入研究和抗耐藥抑制劑的篩選提供了有效的平臺。

【關(guān)鍵詞】 K562； STI571； 耐藥； BCR-ABL

Establishment and Characterization Study of STI571-resistant K562 Cell Line/ZHANG Qiong，WANG Li-li，YANG Li-hong.//Medical Innovation of China，2014，11（16）：001-004

【Abstract】 Objective：To establish a STI571-resistant K562 cell line and investigate its biological characteristics and resistance pathogenesis.Method：By incrementing STI571 concentration， a human leukemia cell line K562/R was established successfully， which had strain resistant to STI571， and investigated its biological characteristics and resistance pathogenesis used RT-PCR， Western-blot， immunohistochemistry and gene sequencing. Result： The K562/R cell line was steady growth and exuberant reproduction at the circumstance contained 1 μmol/L STI571. Compared to parental K562 cells， its resistance level to STI57 up to 235 times， at the same time it had varying degrees cross-resistance to HHT， DNR and VCR， compared with K562 cells， the difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with the parental sensitive K562 cells， BCR-ABL gene expression level was raised， BCR-ABL protein and its kinase expression excessive.Conclusion：Successfully establish a STI571-resistant human leukemia cell line K562/R， and investigate its biological characteristics and resistance pathogenesis， those provided an effective platform for further research of STI571 drug resistance mechanism and screening for anti-drug inhibitor.

【Key words】 K562； STI571； Resistance； BCR-ABL

First-authors address：Heilongjiang Institute of Inspection for Food and Drug，Harbin 150001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.16.001

白血?。╨eukemia），俗稱的血癌，是由多種病因誘發(fā)的一類造血干細(xì)胞克隆性惡性疾病，國內(nèi)的發(fā)病率約為10萬分之2.76，為兒童和35歲以下成人死亡的主要病因[1-2]。慢性髓性白血病（CML）是一種起源于造血干細(xì)胞的惡性增生性疾病，臨床上分期有慢性期、加速期和急變期[3]。該疾病，主要是由于BCR-ABL基因的變異致使BCR-ABL融合蛋白的異常表達(dá)，進(jìn)而使得細(xì)胞分裂的方式不再受正?？刂?，促使白細(xì)胞的異常增殖進(jìn)而導(dǎo)致該疾病的發(fā)生[4-5]。CML在國內(nèi)占各類白血病的15%～20%，占各種慢性病的95%，病程一般持續(xù)4年左右，隨著疾病進(jìn)展對治療的逐漸不敏感，因此該疾病對我國人口健康造成了很大的危害[6]。

STI571，商品名為格列衛(wèi)（Glivec或Gleevec）為近年來開發(fā)的基因靶向治療藥物，根據(jù)CML的分子發(fā)病機(jī)制，以BCR-ABL蛋白激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，人工合成了ABL激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)競爭性抑制劑，是針對CML特異的分子異常進(jìn)行的一種靶向分子藥物。盡管大多數(shù)CML患者對STI571具有明顯的血液和細(xì)胞遺傳學(xué)反應(yīng)，但相當(dāng)一部分患者，尤其是加速期和急變期患者對STI571產(chǎn)生了原發(fā)或獲得性耐藥，在臨床上嚴(yán)重影響了該藥的治療效果，從而約束了STI571的應(yīng)用[7-8]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立耐STI571的K562細(xì)胞株，對其生物學(xué)特性進(jìn)行考察，研究其致病機(jī)理。研究FDB聯(lián)合STI571誘導(dǎo)K562細(xì)胞耐藥性的差異，并對其治療效果進(jìn)行研究分析，探討耐藥機(jī)理，為抗耐藥的治療途徑及開發(fā)新的治療藥物提供一些參考和思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用細(xì)胞 人白血病細(xì)胞株K562（購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耐STI571細(xì)胞株建立 取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，通過逐漸遞增STI571的濃度，誘導(dǎo)在1 μmol/L STI571的條件下，穩(wěn)定生長，快速增殖的細(xì)胞株命名為K562/R細(xì)胞株。

1.2.2 MTT法測定K562/R細(xì)胞對STI571及常見化療藥物的IC50 取脫離STI571培養(yǎng)2周的K562/R細(xì)胞和敏感株K562細(xì)胞接種于96孔板，加入以RPMI1640培養(yǎng)稀釋的不同濃度的STI571，以相同體積的培養(yǎng)液為空白對照，通過MTT法測定藥物的抑制率，并計(jì)算其對STI571的IC50。

1.2.3 RT-PCR檢測K562/R細(xì)胞BCR-ABL基因的表達(dá)及序列分析 提取K562/R細(xì)胞總RNA并對其量和純度進(jìn)行鑒定，反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增BCR-ABL基因，對BCR-ABL擴(kuò)增產(chǎn)物回收并測序。

1.2.4 蛋白免疫印跡（Western blot）測定K562/R細(xì)胞BCR-ABL蛋白及其酪氨酸激酶的表達(dá) 提取K562/R細(xì)胞總蛋白，采用Lowry法測定蛋白濃度，將轉(zhuǎn)移至膜的BCR-ABL蛋白用ALPHA INNOTECH化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描，以各組目的蛋白條帶光密度值對內(nèi)參蛋白光密度值計(jì)算相對比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

3 討論

CML患者有90%以上存在特征性的pH染色體及BCR-ABL融合基因，其治療關(guān)鍵是在慢性期能否夠獲得分子水平的緩解。STI571是一種針對CML的靶向藥物，該類酪氨酸激酶抑制劑，為CML的治療帶來了希望[9]。然而，CML患者對酪氨酸激酶抑制劑的治療反應(yīng)與個(gè)體BCR-ABL基因變異密切相關(guān)，另外在CML的治療過程中，研究人員和醫(yī)療人員發(fā)現(xiàn)，使用STI571治療數(shù)周或者數(shù)月內(nèi)，多數(shù)患者出現(xiàn)了不同程度的耐藥性，同時(shí)臨床上STI571的使用頻率不斷增加，目前STI571引起的耐藥性問題越來越嚴(yán)重[10-11]。在耐藥和復(fù)發(fā)性CML患者中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)100種BCR-ABL基因的突變[12]。這些變異干擾激酶抑制劑的親和力，同時(shí)也改變了BCR-ABL的生物學(xué)功能，其中有些變異具有廣泛耐藥行性，是目前臨床上最難以克服的一種基因突變[13-15]。

本實(shí)驗(yàn)通過逐步增加STI571濃度的作法，最終得到了與敏感細(xì)胞相比耐藥倍數(shù)為235倍的K562/R細(xì)胞株，該細(xì)胞在STI571作用下，細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，生長穩(wěn)定，增殖迅速；繪制細(xì)胞的生長曲線發(fā)現(xiàn)，K562/R細(xì)胞生長趨勢與正常K562細(xì)胞沒有太大差異。通過RT-PCR檢測到K562/R細(xì)胞BCR-ABL基因mRNA水平升高，其編碼的BCR-ABL蛋白過度表達(dá)，致使BCR-ABL激酶重新活化，過度增殖，表明BCR-ABL基因及其表達(dá)產(chǎn)物與CML的STI571耐藥密切相關(guān)。在對耐藥細(xì)胞交叉耐藥性的檢測，表明耐藥細(xì)胞對HHT、VCR、DNR具有不同程度的交叉耐藥性，與敏感細(xì)胞株相比具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），BCR-ABL基因和表達(dá)產(chǎn)物與其他藥物的耐藥性可能存在相關(guān)性，相應(yīng)結(jié)果和結(jié)論還有待于進(jìn)一步探討和驗(yàn)證[16-20]。

綜上所述，本研究成功建立的K562/R細(xì)胞株，為STI571耐藥機(jī)制的研究和抗耐藥抑制劑的體外篩選提供了有效的實(shí)踐平臺。初步分析了BCR-ABL基因及其表達(dá)產(chǎn)物與CML的STI571耐藥和交叉耐藥性的相關(guān)性。雖然STI571產(chǎn)生了耐藥，但相信隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展以及輔助設(shè)計(jì)的深入，耐藥機(jī)制謎團(tuán)的進(jìn)一步解釋，在CML治療過程中患者對酪氨酸激酶抑制劑的耐藥性最終會得到解決。同時(shí)由于STI571的出現(xiàn)開創(chuàng)了靶標(biāo)藥物的新時(shí)代，結(jié)合高通量篩選、分子模擬和各種生物技術(shù)在藥物研究中的聯(lián)合應(yīng)用，目前已有許多類似新藥帶來令人振奮的效果，其中AMN107和BMS-354825兩種化合物有望彌補(bǔ)STI571耐藥的缺陷。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2014-03-28） （本文編輯：蔡元元）

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（收稿日期：2014-03-28） （本文編輯：蔡元元）