張強(qiáng)，郭元，韓德明

（長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130022）

釀酒酵母乙醇耐受性的研究進(jìn)展

張強(qiáng)，郭元，韓德明

（長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130022）

釀酒酵母是重要的工業(yè)微生物之一，具有發(fā)酵速度快、乙醇產(chǎn)量高特性，主要應(yīng)用于乙醇和釀酒行業(yè)。但在發(fā)酵過程中，隨著乙醇積累會對酵母細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，從而抑制了菌體細(xì)胞生長和乙醇進(jìn)一步形成。因此，對釀酒酵母乙醇耐受性機(jī)制研究具有重要的理論和實(shí)際意義，也為選育具有較強(qiáng)乙醇耐受性的酵母菌種提供了理論基礎(chǔ)。本文綜述了釀酒酵母乙醇耐受性研究進(jìn)展，介紹了釀酒酵母乙醇發(fā)酵途徑、乙醇耐受性機(jī)理，主要闡述了提高酵母乙醇耐受性方法。指出加強(qiáng)酵母乙醇耐受性機(jī)理研究，了解乙醇耐受性與其他脅迫耐受性聯(lián)系，最終提高酵母菌乙醇轉(zhuǎn)化效率是未來研究關(guān)鍵。

乙醇；發(fā)酵；耐受性；釀酒酵母

自從20世紀(jì)70年代爆發(fā)石油危機(jī)以來，燃料短缺以及日趨惡化的環(huán)境問題，使燃料乙醇作為生物質(zhì)能源越來越受到人們關(guān)注。作為可再生的清潔能源，燃料乙醇已經(jīng)率先實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用[1]。

在乙醇生產(chǎn)過程中，濃醪發(fā)酵已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。采用濃醪發(fā)酵可使發(fā)酵液中乙醇含量達(dá)到17.5%以上，而普通酵母菌發(fā)酵只能產(chǎn)生9%～11%乙醇。另外濃醪發(fā)酵還可有效降低蒸餾時的能耗，提高設(shè)備利用率。釀酒酵母在濃醪乙醇發(fā)酵過程中發(fā)揮了重要作用，它具有良好的生長能力，較高的乙醇得率，對一些生長抑制因子如乙醇、乙酸等具有較高的耐受性，因此在今天乙醇發(fā)酵工業(yè)得以廣泛應(yīng)用[2-3]。但是在發(fā)酵過程中往往會受到脅迫條件，例如乙醇毒性的影響，當(dāng)發(fā)酵醪液中乙醇達(dá)到一定濃度時，會抑制酵母菌的生長以及乙醇進(jìn)一步形成，從而影響了乙醇產(chǎn)量。由于細(xì)胞中的許多組分與酵母菌耐乙醇能力關(guān)系密切，并且細(xì)胞的許多基因也控制著酵母菌耐乙醇的特性。因此，酵母菌耐乙醇的機(jī)理十分復(fù)雜，研究釀酒酵母乙醇耐受性機(jī)制具有十分重要的意義。

本文主要介紹了釀酒酵母乙醇發(fā)酵途徑、乙醇耐受性機(jī)理，重點(diǎn)對如何提高酵母乙醇耐受性的方法進(jìn)行綜述。

1 釀酒酵母乙醇生成途徑

葡萄糖是很容易利用的碳源，許多微生物都能夠利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。酵母菌在厭氧條件下進(jìn)行葡萄糖乙醇發(fā)酵，發(fā)酵過程包括葡萄糖酵解和丙酮酸的無氧降解兩大生化反應(yīng)過程[4]。該過程主要由兩個階段組成，第一階段葡萄糖通過糖酵解途徑分解成丙酮酸；第二階段丙酮酸由脫羧酶催化生成乙醛和二氧化碳，乙醛進(jìn)一步被還原成乙醇，見圖1。

圖1 葡萄糖乙醇發(fā)酵途徑

2 乙醇耐受性定義及機(jī)理

2.1 乙醇耐受性定義

乙醇發(fā)酵過程中，隨著乙醇濃度增加會對酵母細(xì)胞生長產(chǎn)生脅迫作用，酵母細(xì)胞為了生存、生長會產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)來應(yīng)對這種脅迫，這種應(yīng)對機(jī)制即是酵母細(xì)胞對乙醇產(chǎn)生了耐受性。但目前還沒有對乙醇耐受性公認(rèn)的定義方法[5]。一般認(rèn)為，乙醇對酵母細(xì)胞的影響主要體現(xiàn)在3個方面，即抑制細(xì)胞生長、細(xì)胞存活和發(fā)酵。因此常通過這3個方面來定義酵母乙醇的耐受性。第一，通過乙醇對細(xì)胞生長影響定義。室溫下，在含1%～14%乙醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，允許生長的最高乙醇濃度即代表了酵母的乙醇耐受水平。其中能在3%～6%乙醇中生長的菌株，乙醇耐受性為差，6%～10%為中等，而10%～13%則為高。這種定義方法比較簡單，常用來篩選具有乙醇耐受性的菌株。第二，通過乙醇對酵母細(xì)胞活性影響定義。在高濃度乙醇發(fā)酵中，細(xì)胞活性喪失是由乙醇致死作用造成，通過這種方法可以了解乙醇對細(xì)胞活性影響。第三，通過酵母產(chǎn)生乙醇的最高含量或濃度定義。此方法通過測定發(fā)酵完成后乙醇最大生成量或濃度來評價酵母的耐受性，因此最具有生產(chǎn)意義[6]。目前對釀酒酵母乙醇耐受性還沒有統(tǒng)一的定義方法。

2.2 乙醇對釀酒酵母細(xì)胞的影響

發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵液里的乙醇濃度增加，乙醇對釀酒酵母毒性增大。高濃度乙醇對細(xì)胞的毒害作用主要表現(xiàn)在對細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞生理活動影響兩個方面[7]。細(xì)胞形態(tài)變化主要表現(xiàn)為細(xì)胞骨架變得疏散，細(xì)胞變大。細(xì)胞生理活動的變化主要體現(xiàn)在以下幾點(diǎn)。①細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)遭到破壞。高濃度的乙醇能增強(qiáng)細(xì)胞膜流動性，破壞細(xì)胞膜膜結(jié)構(gòu)，從而影響細(xì)胞膜對葡萄糖、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)吸收。②生物大分子物質(zhì)的合成與代謝受阻。③糖酵解相關(guān)酶酶活性變化等。聶妤等[8]考察了在乙醇體積分?jǐn)?shù)2%、4%、6%、8%時酵母細(xì)胞糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)中關(guān)鍵代謝節(jié)點(diǎn)處的酶活力。發(fā)現(xiàn)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶乙醇的耐受能力較強(qiáng)；丙酮酸激酶、異檸檬酸脫氫酶和乙醇脫氫酶表現(xiàn)出對乙醇的耐受力較差；蘋果酸脫氫酶和異檸檬酸裂解酶表現(xiàn)出對乙醇良好的耐受性。

2.3 釀酒酵母對乙醇耐受性機(jī)理

大量研究表明，釀酒酵母乙醇耐受性與細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)密切相關(guān)。

2.3.1 酵母細(xì)胞乙醇耐受性與細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的關(guān)系

酵母細(xì)胞壁主要由纖維素組成，外層為甘露聚糖，中間是一層蛋白質(zhì)分子，內(nèi)層為葡聚糖。它具有一定韌性，可以使酵母保持特殊的形狀。當(dāng)乙醇濃度過高時，乙醇能夠誘導(dǎo)SP11基因表達(dá)細(xì)胞壁蛋白，該蛋白可與細(xì)胞壁上的β-1,6葡聚糖和β-1,3葡聚糖結(jié)合，形成糖蛋白固定在細(xì)胞壁上，從而提高了菌體對乙醇耐受性能[9]。酵母菌的細(xì)胞膜是由磷脂雙分子層構(gòu)成，中間嵌有甾醇和蛋白質(zhì)。疏水基相互作用是維持細(xì)胞膜穩(wěn)定的主要作用力，乙醇可攻擊細(xì)胞膜組分中長鏈烴基形成的膜疏水核心，導(dǎo)致細(xì)胞膜滲透屏障下降，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，包括酶促反應(yīng)的輔酶和輔助因子的泄漏，從而抑制菌體的乙醇發(fā)酵作用[10]。

2.3.2 酵母細(xì)胞乙醇耐受性與氨基酸及糖類之間的關(guān)系

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，賦予蛋白質(zhì)特定的分子結(jié)構(gòu)形態(tài)，使它具有生化活性。氨基酸作為細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，在高溫、乙醇等逆環(huán)境下，能夠穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)，參與蛋白質(zhì)裝配、折疊、防止逆環(huán)境下蛋白質(zhì)變性、凝集等，從而提高了細(xì)胞對不良環(huán)境的耐受性。海藻糖、糖原等糖類物質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定。在逆境脅迫下可以抑制己糖激酶的活性，防止葡萄糖過度磷酸化，保證細(xì)胞正常的新陳代謝活動，穩(wěn)定蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子結(jié)構(gòu)等作用，使細(xì)胞能夠抵抗不良環(huán)境的影響。另外在乙醇脅迫一定時間后，酵母細(xì)胞內(nèi)的海藻糖、脯氨酸含量會增加[11]。

3 提高酵母乙醇耐受性的方法

根據(jù)已知的乙醇耐受性機(jī)制，研究人員通過添加培養(yǎng)基成分、改變發(fā)酵操作條件或方式以及通過酵母菌株選育等方法提高酵母菌耐乙醇的能力，從而提高發(fā)酵工業(yè)乙醇產(chǎn)量。

3.1 添加培養(yǎng)基成分

培養(yǎng)基是酵母菌營養(yǎng)和能量的來源，在發(fā)酵過程中起著非常重要的作用。大量研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入適量的營養(yǎng)物質(zhì)，如海藻糖、脂肪酸以及肌醇等，都可以有效提高酵母菌耐乙醇能力。

Casey等[12]認(rèn)為，營養(yǎng)物質(zhì)是酵母菌生長及代謝的重要物質(zhì)，如果能夠滿足菌體的營養(yǎng)需要，可促進(jìn)乙醇發(fā)酵速度和增加乙醇濃度。Thomas等[13]采用高糖濃度小麥粉液為發(fā)酵原料的試驗中，證實(shí)發(fā)酵過程中添加酵母提取物可使乙醇產(chǎn)量達(dá)到20.4%，表明發(fā)酵過程中添加營養(yǎng)物可有效提高乙醇含量。

飽和脂肪酸（例如棕櫚酸、硬脂酸）和不飽和脂肪酸（例如油酸）都可以通過增強(qiáng)細(xì)胞膜滲透屏障來提高菌體的耐乙醇能力， 表明它們在釀酒酵母乙醇耐受性方面具有一定的作用。邢建宇等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在對釀酒酵母乙醇耐受性的影響方面，油酸的作用更為明顯。在乙醇發(fā)酵方面，硬脂酸的影響更為明顯，其中添加硬脂酸乙醇產(chǎn)率最高達(dá)到8.7%，見表1。另外研究也發(fā)現(xiàn)脂肪酸不飽和性也影響酵母乙醇耐受性，培養(yǎng)基的乙醇增加使釀酒酵母質(zhì)膜中不飽和長鏈脂肪酸（例如油酸）增多，飽和脂肪酸（例如棕櫚酸）的數(shù)量降低。

表1 脂肪酸對乙醇產(chǎn)率的影響

胡純鏗等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中分別添加棕櫚酸、亞油酸和亞麻酸，發(fā)現(xiàn)富含棕櫚酸的酵母細(xì)胞存活率最高。另外考察了菌體在30℃、15% 乙醇沖擊下的細(xì)胞膜透性，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜富含棕櫚酸的菌體具有較強(qiáng)耐乙醇能力，表明乙醇沖擊酵母菌細(xì)胞膜從而引起細(xì)胞內(nèi)重要物質(zhì)泄漏，可能是乙醇毒害酵母菌的主要方式。細(xì)胞膜富含棕櫚酸，可明顯增強(qiáng)細(xì)胞膜滲透屏障，有效防止細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏，從而提高了菌體耐乙醇能力。

除了脂肪酸，其他物質(zhì)，如酵母膏、蛋白胨以及肌醇等也能夠有效提高酵母菌的乙醇耐受性。邢建宇等[16]采用Plackett-Burman 設(shè)計方法研究了培養(yǎng)基組分對釀酒酵母生長以及乙醇耐受能力的影響。發(fā)現(xiàn)酵母膏對釀酒酵母影響最大，KH2PO4最小。分別提高酵母膏和蛋白胨含量，都可以在發(fā)酵各個階段提高酵母細(xì)胞乙醇耐受性及發(fā)酵能力。另外還發(fā)現(xiàn)含酵母膏的培養(yǎng)基針對乙醇沖擊，能及時有效的使酵母菌恢復(fù)生長和繁殖能力。

肌醇是磷脂的重要組分之一，而磷脂是細(xì)胞膜的最重要成分，所以肌醇在酵母耐乙醇能力方面可能起著重要的作用。季冉等[17]在培養(yǎng)基中加入肌醇，在發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)，隨肌醇濃度的增加，乙醇的生成量呈上升趨勢，但當(dāng)肌醇濃度繼續(xù)增加時，乙醇濃度反而下降。當(dāng)乙醇起始體積分?jǐn)?shù)分別為10%和12%時，隨肌醇濃度的增加，乙醇的生成量呈上升趨勢，結(jié)果見表2。表明高濃度肌醇能夠?qū)|(zhì)膜ATP酶和質(zhì)膜完整性起保護(hù)作用，以免受高濃度乙醇毒害，因此隨肌醇濃度增加，酵母乙醇耐受性增加。另外酵母細(xì)胞能夠利用肌醇合成磷脂酰肌醇，從而發(fā)酵生成乙醇。

高底物濃度會導(dǎo)致高滲透壓和低水活性，而高滲透壓則會抑制酵母生產(chǎn)的乙醇向培養(yǎng)基中擴(kuò)散，從而造成對酵母細(xì)胞的毒害作用。為了維持細(xì)胞存活性，必須減小培養(yǎng)基的滲透壓。Thomas 和Hynes 等[18]發(fā)現(xiàn)采用釀酒酵母NCYC 1324作為發(fā)酵菌種，當(dāng)培養(yǎng)基中添加甘氨酸和脯氨酸，發(fā)酵過程中菌體存活率可達(dá)80%以上，而沒有添加的為12%以下。甘氨酸和脯氨酸雖然不是細(xì)胞生長的良好氮源，但可以直接或間接地作為細(xì)胞滲透壓保護(hù)劑，有助于增加乙醇產(chǎn)量，提高糖利用率。薛穎敏等[19]利用滲透壓保護(hù)劑和營養(yǎng)物質(zhì)對釀酒酵母X330 耐乙醇性能進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物質(zhì)對酵母耐乙醇性能影響順序為：酵母抽提物＞ 蛋白胨＞ 硫酸鎂＞ 維生素C = 磷酸二氫鉀＞ 氯化鈣 = 硫酸銨。甘氨酸和脯氨酸作為滲透壓保護(hù)劑能有效提高菌體乙醇耐受性能，甘氨酸的促進(jìn)作用強(qiáng)于脯氨酸。但與滲透壓相比，營養(yǎng)物質(zhì)缺乏對釀酒酵母乙醇耐受性能起著更為重要的作用。

因此，在高濃度乙醇發(fā)酵時，添加適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)物質(zhì)，一方面可以起到提供營養(yǎng)的作用，另一方面也可以促進(jìn)酵母細(xì)胞生長和保護(hù)酵母細(xì)胞免受脅迫傷害的作用 。

3.2 改變發(fā)酵操作條件或方式

高底物濃度能夠獲得高濃度的乙醇，但高底物濃度會導(dǎo)致高滲透壓。為了維持細(xì)胞存活性，必須減小培養(yǎng)基的滲透壓。一個有效的方法就是改變發(fā)酵操作條件或方式。

表2 肌醇對酵母的產(chǎn)乙醇能力和發(fā)酵耐乙醇能力的影響

在乙醇發(fā)酵過程中，解除產(chǎn)物抑制一直是提高濃度乙醇發(fā)酵的關(guān)鍵。膜分離、抽提及閃蒸等工藝可有效地分離移除乙醇，降低或消除對酵母生長影響。真空抽提是最早提出的同步發(fā)酵乙醇移除工藝。Costa 等[20]在發(fā)酵過程中通過在發(fā)酵容器上方連接真空泵形成低壓狀態(tài)，可將揮發(fā)性高的乙醇從發(fā)酵液中抽提出來，從而獲得了23.0～26.7 g/(L·h) 的乙醇產(chǎn)率。

Dombek等[21]發(fā)酵過程中將底物分4 批加入發(fā)酵培養(yǎng)基中。第一批開始流加，另外3批發(fā)酵后期流加，所獲得的乙醇產(chǎn)量比分批操作要高。表明改變流加條件對酵母細(xì)胞的代謝活動產(chǎn)生明顯影響，分批流加或連續(xù)流加都能夠提高最終發(fā)酵乙醇濃度。

同步糖化發(fā)酵技術(shù)（SSF）將淀粉水解后的糖化與發(fā)酵過程相結(jié)合，葡萄糖一經(jīng)水解即刻被酵母吸收轉(zhuǎn)化為乙醇，可顯著緩解高葡萄糖濃度對酵母的影響。Madson 等[22]在谷物發(fā)酵中采用SSF，每批次乙醇產(chǎn)量達(dá)2.75～2.8 gal/bushel，不僅有效解除了抑制作用并改善了發(fā)酵液的黏稠性。Sathaporn 等[23]采用固形物含量為304 g/L 土豆原料，首先加入果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶降低原料的黏度，然后經(jīng)過液化和糖化作用，30 ℃下進(jìn)行SSF，乙醇產(chǎn)量為16.61%，相當(dāng)于理論乙醇產(chǎn)量的89.7%。晏輝等[24]以餐廚垃圾為原料，應(yīng)用同步糖化發(fā)酵制取燃料乙醇，在適宜的乙醇發(fā)酵條件范圍內(nèi)，乙醇產(chǎn)量最高為15.3 mL/100 g 有機(jī)垃圾。

將同步糖化發(fā)酵工藝與分離技術(shù)相結(jié)合，即發(fā)酵耦合分離技術(shù)，也是提高乙醇發(fā)酵的有效方式。常春等[25]采用蒸汽爆破的玉米秸稈為原料，采用預(yù)酶解補(bǔ)料和耦合真空分離技術(shù)進(jìn)行活性干酵母乙醇發(fā)酵。當(dāng)原料質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時，乙醇得率為44.98%，生產(chǎn)強(qiáng)度0.40 g/(L·h)，有效提高了乙醇產(chǎn)量。

3.3 酵母菌株選育

通過篩選、誘變、原生質(zhì)體融合、基因重組等技術(shù)可提高乙醇酵母的耐受性。

篩選通常是采用把細(xì)胞逐漸暴露于更高的乙醇濃度下進(jìn)行。易弋等[26]從乙醇廠廢液、土壤等不同樣品中，篩選得到兩株乙醇耐受性酵母菌株TM8 和TM231，在含150 g/ L 葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，TM8 和TM23所得的乙醇終體積分?jǐn)?shù)分別為4.0%和3.5% ，表明M8是一個非常有潛力的濃醪乙醇發(fā)酵生產(chǎn)菌株。吳華昌等[27]從白酒窖池的酒糟中經(jīng)過富集培養(yǎng)篩選出一株能耐18%乙醇的酵母菌株A2。

原生質(zhì)體融合技術(shù)最近在工業(yè)酵母菌株基因修飾中得到廣泛應(yīng)用，該方法使用兩種互補(bǔ)的營養(yǎng)缺陷型子代菌株，經(jīng)原生質(zhì)體混合處理，篩選融合子。黎碧蓮等[28]通過原生質(zhì)體融合技術(shù)，在釀酒酵母與扣囊內(nèi)孢霉屬間原生質(zhì)體融合產(chǎn)物中，獲得兼有兩親株遺傳特性的融合子P501和P519，然后進(jìn)行了木薯粉的發(fā)酵試驗。結(jié)果表明，與親本株相比，乙醇得率分別提高7.48%和10.89%。陳國潮等[29]通過原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得的釀酒酵母菌株HU-TY-1A 與糖化酵母菌5206-1B 的不同核倍性融合株，40 ℃時發(fā)酵能力及耐乙醇能力都明顯優(yōu)于雙親株。相信隨著技術(shù)的不斷完善，原生質(zhì)體融合在耐乙醇酵母選育中占有的地位會越來越重要。

紫外線照射會導(dǎo)致基因發(fā)生突變，然后再對各種突變品系進(jìn)行篩選，也就是誘變育種技術(shù)。彭源德等[30]從22 個樣品中分離得到4株在40 ℃均能較好生長的耐高溫酵母菌，通過紫外誘變育種，獲得1 株能夠耐受40℃高溫和16%乙醇的酵母S132，當(dāng)培養(yǎng)基中乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%時，耐乙醇能力比對照高31%左右。徐日益等[31]以新橋釀酒酵母為親株，采用紫外照射進(jìn)行誘變，得到U9、U59 和U71 3株耐乙醇誘變株。然后分別測定了在含有14%乙醇的麥芽汁中培養(yǎng)24 h 后的菌體存活率、60 ℃熱沖擊10 min 菌體存活率以及最終乙醇發(fā)酵濃度，結(jié)果見表3。表明通過紫外誘變?nèi)缓蟮玫降? 株誘變菌，在耐乙醇性能、耐熱性能以及耐滲透壓性能上都優(yōu)于親株，而且通過實(shí)驗驗證了交叉耐受性這一現(xiàn)象，即一種耐受性能的改變，其他耐受性能也隨之改變的現(xiàn)象。

基因重組技術(shù)也是改造酵母菌乙醇耐性、高溫耐性等復(fù)雜性狀的有效手段之一。Shi等[32]對釀酒酵母SM-3采用基因重組技術(shù)獲得了一個突變株F34，該菌株在45～48 ℃、200 g/L葡萄糖培養(yǎng)基中可產(chǎn)生99.5 g/L乙醇，最高能耐受55 ℃高溫和25%乙醇，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于出發(fā)菌株。Hou[33]采用基因重組技術(shù)獲得了一個突變株S3-10，它不但能耐受較高乙醇濃度，而且能夠耐高葡萄糖和高溫，乙醇得率達(dá)到10.96%。通過基因重組技術(shù)獲得的菌株具有極大的實(shí)際生產(chǎn)潛能，將在微生物菌株選育方面發(fā)揮越來越重要的作用，促進(jìn)菌株選育工作在技術(shù)方法和路線上變革，開創(chuàng)菌種改良和改造新局面。

表3 4種菌株各種參數(shù)對比

4 結(jié) 論

目前關(guān)于酵母乙醇耐受性的研究很多，雖然在應(yīng)用研究上，通過添加培養(yǎng)基成分、改變培養(yǎng)條件以及微生物選育等方式已使釀酒酵母耐受乙醇的能力大為提高，但乙醇耐性機(jī)理還并不十分清楚。酵母細(xì)胞的乙醇耐受性受多種基因控制，而且各基因之間的聯(lián)系錯綜復(fù)雜，所以人們?nèi)匀恍枰獙湍妇肿訖C(jī)制進(jìn)一步研究。相信隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)以及細(xì)胞代謝工程的進(jìn)一步發(fā)展，人們將會獲得更多的相關(guān)基因信息。

釀酒酵母乙醇耐受性分子機(jī)理研究將成為未來研究熱點(diǎn)及焦點(diǎn)，不斷涌現(xiàn)的相關(guān)研究成果，將使人們能夠不斷獲得高乙醇耐受性的新型釀酒酵母以及找到新的方法提高發(fā)酵乙醇產(chǎn)量。提高酵母菌的生物轉(zhuǎn)化效率是最終目標(biāo)，將有利于推動燃料乙醇的生產(chǎn)和釀酒業(yè)的發(fā)展。

但也應(yīng)注意到，對酵母細(xì)胞乙醇發(fā)酵性能的影響是多方面的。酵母菌在工業(yè)生產(chǎn)中除了受乙醇的毒性影響外，還受到許多其他脅迫因素的影響，如高溫、高滲透壓等，它們之間具有一定的聯(lián)系。因此在研究乙醇耐性的同時，也應(yīng)該同時關(guān)注其他耐性條件的影響。單一脅迫影響因素以及它們之間交叉關(guān)聯(lián)性的研究將有助于解釋酵母的耐受機(jī)制，為選育工業(yè)生產(chǎn)上對多種環(huán)境脅迫因素具有較強(qiáng)耐性的釀酒酵母提供了保證。

[1] Madhavan. Bioconversion of lignocellulose-derived sugars to ethanol by engineered Saccharomyces cerevisiae[J]. Critical Reviews in Biotechnology，2012，32：22-48.

[2] 張秋美，趙心清，姜如嬌，等. 釀酒酵母酒精耐性的分子機(jī)制及基因工程改造[J]. 生物工程學(xué)報，2009，25（4）：481-487.

[3] Menggen Ma. Mechanisms of ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2010，87 （3）：829-845.

[4] 楊忞，張金鑫，田沈，等. 穩(wěn)定代謝葡萄糖和木糖產(chǎn)酒精的工程菌初 步構(gòu)建[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2009，15（2）：258-261.

[5] 賀家明，趙祥穎，陳蘇萍. 酵母耐酒精性狀及提高其酒精耐性的途徑[J]. 釀酒科技，2000（2）：6-9.

[6] 王濱，張國政，路福平，等. 酵母酒精耐性機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2001（1）：18-22.

[7] 張敏，毛健，黃桂東. 清酒釀酒酵母酒精耐受機(jī)理的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2012（20）：342-346.

[8] 聶妤，董亮，侯德文. 釀酒酵母胞內(nèi)代謝關(guān)鍵酶對酒精的耐受性[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011（5）：318-321

[9] 張穗生，黃日波，周興. 釀酒酵母酒精耐受性機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報，2009（10）：1604-1608

[10] Aguilera F，Peinado RA，Millán C，et al. Relationship between ethanol tolerance，H+-ATPase activity and the lipid composition of the plasma membrane in different wine yeast strains[J]. Int. J.Food Microbiol.，2006，110（1）：34-42.

[11] Malhotra R，Singh B. Ethanol-induced changes in glycolipids of Saccharomyces cerevisiae[J]. Appl. Biochem. Biotechnol.，2006，128 （3）：205-213.

[12] Casey G P，Magnus C A. Influence of media composition on fermentation[J] .Biotechnol. Lett.，1983（5）：429-434.

[13] Thomas K C，Ingledew W M. Production of 21% （V/V） ethanol by fermentation of very high gravity wheat mashes[J]. Journal of Industrial Microbiology，1992（10）：61- 68

[14] 邢建宇，李春榮，林挺花，等. 脂肪酸對釀酒酵母酒精耐受性的影響[J].食品研究與開發(fā)，2009，30（6）：33-35

[15] 胡純鏗，白鳳武，安利佳. 膜蛋白氨基酸組成通過改變膜流動性影響粟酒裂殖酵母和釀酒酵母融合株耐酒精能力[J]. 生物工程學(xué)報，2005，21（5）：809-813

[16] 邢建宇，楊莉.培養(yǎng)基中各營養(yǎng)組分對釀酒酵母發(fā)酵的影響[J]. 食品研究與開發(fā)，2011，30（2）：139-142.

[17] 季冉，袁興中，曾光明. 外加肌醇和氯化鈉對嗜鞣管囊酵母生長和產(chǎn)酒精能力及耐酒精能力的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2008，27（5）：2080- 2085.

[18] Thomas K C，Hynes S H，Ingledew W M. Effect of particulate materials and osmoprotectants on very high gravity ethanlic fermentation[J]. Applied and Environmental Microbiology，1994，1519-1524.

[19] 薛穎敏，江寧. 釀酒酵母X330 高濃度發(fā)酵時耐酒精性能的初步研究[J]. 生物工程學(xué)報，2006，22（3）：508-513.

[20] Costa A C，Atala D I P，Maugeri F，et al. Factorial design and simulation for the optimization and determination of controlstructures for an extractive alcoholic fermentation[J]. Process Biochemistry，2001，37：125-137.

[21] Dombek K M，Ingram L O J. Alter the substrate feeding condition for ethanol production[J] . Ind. Microbiol.，1986（1）：219-225.

[22] Madson P W，Monceaux D A. Alcohol Textbook：Fuel Ethanol Production[M]. UK：The Nottingham University Press，1995：257-268.

[23] Sathaporn S，Maki F，Wang X H，et al. Simultaneous saccharification and fermentation （SSF） of very high gravity （VHG） potato mash for the production of ethanol[J]. Biomass and Bioenergy，2009，33 （5）：390-398.

[24] 晏輝，馬鴻志，汪群慧. 同步糖化發(fā)酵從餐廚垃圾生產(chǎn)燃料酒精的研究[J]. 環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展，2007（3）：37-39

[25] 常春，王鐸，王林風(fēng). 高底物濃度纖維酒精同步糖化發(fā)酵工藝的比較[J]. 化工學(xué)報，2012，63（5）：935-940

[26] 易弋，伍時華.酒精耐受性酵母菌的篩選[J]. 廣西工學(xué)院學(xué)報 ，2008（3）：42-46

[27] 吳華昌，肖振，鄧靜，等. 一株耐高濃度乙醇酒精酵母的篩選及發(fā)酵特性的研究[J]. 中國釀造，2012（3）：111-114

[28] 黎碧蓮，涂桂洪. 釀酒酵母與扣囊內(nèi)孢霉屬間原生質(zhì)體融合的研究[J]. 暨南大學(xué)學(xué)報，1998（4）：24-29.

[29] 陳國潮，曾云中. 釀酒酵母和糖化酵母核倍性株的生長與生理特性研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1998，24（3）：263-267.

[30] 彭源德，朱作華，唐守偉. 耐高溫、高濃度酒精酵母的選育與耐受性能初步鑒定[J]. 中國麻業(yè)科學(xué)，2010（3）：135-142

[31] 徐日益，梁磊，潘琢. 耐酒精酵母菌株的選育及其交叉耐受性的研究[J]. 釀酒科技，2007（10）：35-40

[32] Shi D J，Wang C L，Wang K M. Genome shuffling to improve thermotolerance ethanol tolerance and ethanol productivity of Saccharomyces cerevisiae[J]. J. Ind. Microbiol. Biotechnol.，2009，36：139-147.

[33] Hou L. Improved production of ethanol by novel genome shuffling in Saccharomyces cerevisiae[J]. Appl. Biochem. Biotechnol.，2010，160 （4）：1084-1093.

Research progress in the ethanol tolerance of yeast

ZHANG Qiang，GUO Yuan，HAN Deming
（School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022，Jilin，China）

The yeast is one of the most widely used industrial microorganisms in ethanol and brewing industry due to its higher ethanol yield and fermentation rate. During fermentation process，the accumulated ethanol plays a toxic role to yeast，which inhibits the growth of yeast and the increase of ethanol production. So research on the tolerance mechanism of yeast is very important in theoretical and practical application. The studies reviewed here not only deepened our knowledge on yeast ethanol tolerance，but also provided a basis for the breeding of yeast strain with improved ethanol tolerance. The research progress in the ethanol tolerance of yeast was addressed. The ethanol formation and tolerance mechanisms of yeast focusing on the methods for improving the ethanol tolerance were introduced. Future research in this area should be focused on the tolerance mechanism，and the connection between ethanol tolerance and other stress tolerance，to ultimately improve the conversion efficiency of ethanol.

ethanol；fermentation；tolerance；yeast

TK 6

A

1000-6613（2014）01-0187-06

10.3969/j.issn.1000-6613.2014.01.033

2013-02-27；修改稿日期：2013-04-08。

吉林省科技發(fā)展重點(diǎn)項目（20120411）及吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（[2014]第34號）。

及聯(lián)系人：張強(qiáng)（1969—），男，博士，副教授，主要從事生物質(zhì)能源研究。E-mail corn11@126.com。