李怡欣,王 凱,陳 敏,李 潔,張明升,趙 青,張軒萍
長期大量飲酒會出現(xiàn)軀體或心理癥狀,不僅造成全身多器官損害,對腦損傷尤其嚴重[1],尸檢發(fā)現(xiàn)27%長期飲酒者顯示小腦變形[2]。酒精中毒后會引起腦血管自身的病變而減少腦血流,造成缺血缺氧改變,導致氧化應激反應和自由基損害組織和細胞[3]。
腦組織如海馬、黑質、紋狀體、蒼白球和小腦等部位均有高密度的ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive K+channels,KATP通道)存在,這些腦區(qū)的神經(jīng)元對缺血缺氧損傷十分敏感[4]。缺氧、代謝毒物均可使KATP活化[5],通過保持細胞內外鉀離子的濃度平衡、減輕細胞內鈣超載、擴張血管、減少ATP消耗等作用對大腦起保護作用[6]。KATP通道在酒精性腦損傷中的作用如何,抗氧化治療能否通過KATP通道發(fā)揮保護腦組織的作用未見相關報道。本實驗擬建立大鼠長期飲酒模型,觀察抗氧化治療對腦組織的保護作用是否有KATP通道參與,為防治酒精性腦損傷提供實驗參考。
1.1 藥品與試劑 維生素C(Vitamin C),太原市振興制藥有限公司,批號:20100919。?;撬幔═aurine),南京制藥廠,批號:980923。50度北京二鍋頭酒由北京皇家京都酒業(yè)有限公司生產(chǎn);無水乙醇由天津市大茂化學試劑廠生產(chǎn)。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒購自南京建成科技有限公司;E.Z.N.A.Tussue RNA Kit總RNA抽提試劑盒(OMEGA BIO-TEK)。RT-PCR二步法試劑盒(寶生物工程大連有限公司,-20℃保存)。
1.2 儀器與設備 721可見分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司);超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司);JY 600電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司);天能凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);MJ Research PTC 100 Thermal Cycler(Waltham,MA,USA)。
1.3 實驗動物 Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠50只,體重200g~220g,由鄭州大學實驗動物中心提供,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(豫)2005-0001。所有大鼠23℃~25℃室內飼養(yǎng),自由飲水或飲酒,自由攝食。動物隨機分為5組,分別為空白對照組(C組)、酒精組(A組)、維生素C組(V組)、?;撬峤M(T組)、維生素C+?;撬峤M(V+T組),每組10只。C組大鼠自由飲水;其余各組大鼠自由飲用白酒[10%(V/V)酒精1周,之后給予20%(V/V)酒精19周,共20周];V組大鼠在飲酒同時加0.05%維生素C;T組大鼠在飲酒同時加2%牛磺酸;V+T組大鼠在飲酒同時加0.05%維生素C和2%?;撬?。
1.4 大鼠腦組織生化指標測定 模型建立20周后,按4mL/kg 25%氨基甲酸乙酯溶液以腹腔注射對大鼠進行麻醉,斷頭處死大鼠,取前腦,沿矢狀縫切開,左側大腦留作分子生物學實驗用,-80℃保存?zhèn)溆茫挥覀饶X組織用生理鹽水制成10%的組織勻漿,4 000r/min離心,取上清液,用試劑盒檢測腦組織中SOD、MDA、GSH-Px含量。
1.5 大鼠腦組織KATPmRNA表達的檢測 取100mg左右腦組織按步驟抽提RNA,測RNA濃度后取3μg行逆轉錄反應得到cDNA,引物按Genebank所提供的基因序列設計,由北京奧科生物技術有限責任公司合成。SUR2A/B前引物:5′-gCAAgAgCgTggAAgAgAC-3′, 后 引 物 5′-TgCCCCAT-gAgAAgTATCC-3′,產(chǎn)物為501bp。內參 GAPDH 前引物5′-TCCTgCACCACCAACTgCTTAg-3′,后引物5′-gATgACCTT-gCCCACAgCCTTg-3′,產(chǎn)物為208bp。SUR2A/B的擴增條件:95℃2min,然后 94℃30s,54 ℃ 30s,72 ℃ 40s(30個循環(huán)),72℃延伸10min。內參GAPDH的擴增條件:94℃2 min,然后94℃ 45s,59℃,45s,72 ℃ 45s(30個循環(huán)),72℃延伸10min。產(chǎn)物進行電泳和拍照。用天能凝膠成像系統(tǒng)觀察結果并掃描保存,進行PCR條帶灰度掃描,以GAPDH作為內參,作半定量分析。SUR2A/B mRNA相對量=SUR2A/B條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。
2.1 各組大鼠腦組織SOD、MDA、GSH-Px含量比較 長期大量飲酒大鼠腦組織MDA含量較對照組顯著升高,SOD和GSH-Px含量則顯著降低(P<0.01)。在飲酒同時加服2%?;撬?,可使大鼠腦組織中MDA含量降低(P<0.05),升高SOD(P<0.05)及GSH-Px活性(P<0.01),但單獨應用0.05%維生素C則無顯著改變。0.05%維生素C與2%牛磺酸合用,增強?;撬岬目寡趸饔茫≒<0.01)。詳見表1。
表1 各組大鼠腦組織SOD、MDA、GSH-Px含量比較(x±s)
2.2 各組大鼠腦組織中SUR2A/B mRNA表達 長期大量飲酒大鼠腦組織中SUR2A/B mRNA表達量較對照組顯著減少(P<0.01);與長期飲酒的大鼠相比,飲酒時加服2%?;撬峄?.05%維生素C和2%牛磺酸合用,可使大鼠腦組織中SUR2A/B mRNA表達量顯著增加(P<0.01)。詳見圖1。
圖1 維生素C合用?;撬釋﹂L期飲酒大鼠腦組織中SUR2A/B mRNA表達的影響
長期大量飲酒腦內大量自由基和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成和堆積,增強氧化應激反應,引起的自由基損害,是造成神經(jīng)系統(tǒng)受損的主要原因[7]。本實驗觀察到長期飲酒使大鼠腦組織MDA含量升高,而SOD和GSH-Px含量降低,表明在長期大量酒精的慢性刺激下,大鼠腦細胞內的脂質過氧化反應增強,而細胞內的抗氧化反應降低。?;撬崤c維生素C合用增加SOD與GSH-Px含量,降低MDA水平,說明抗氧化劑能通過抑制氧化應激反應而減輕酒精對大鼠腦的損傷作用。
KATP通道是一類由磺酰脲類受體(Sulfonylurea receptor,SUR)亞家族亞基與內向整流鉀通道(inwardly rectified potassium channel,Kir)亞基組成的異源性多聚體,由4個內向整流鉀通道(Kir6.1或Kir6.2)亞單位和4個調節(jié)性磺脲類受體(SUR1,SUR2A 或 SUR2B)組成[8]。研究證明[9],KATP通道開放能使細胞膜超極化,降低神經(jīng)元興奮性,從而防止神經(jīng)細胞的興奮毒作用氧自由基級聯(lián)反應所引起的脂質過氧化損傷。本實驗發(fā)現(xiàn),長期大量飲酒使大鼠腦組織中SUR2A/B mRNA表達量顯著減少,這表明酒精慢性攝入抑制了KATP通道的表達量。實驗中使用?;撬嵋约昂嫌镁S生素C能使長期飲酒大鼠腦組織SUR2A/B mRNA表達量顯著增加,表明其抗氧化作用可能有KATP通道的作用參與。
綜上所述,?;撬峒捌浜嫌镁S生素C對長期飲酒大鼠腦損傷有積極的保護作用,該作用與其抗氧化及上調KATP通道m(xù)RNA表達有關。
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