彭樹英，雍德祥，王永生

（淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000）

家禽性別與其生產(chǎn)力密切相關(guān)［1］.從分子水平上鑒定禽類性別，為禽類早期胚胎性別鑒定及禽類發(fā)育生物學(xué)研究提供有意義的途徑［2～4］.分子方法主要通過檢測W染色體上的性連鎖基因及序列實現(xiàn)家禽性別鑒定的.鑒定禽類性別的分子生物學(xué)方法很多，相比較而言，PCR技術(shù)更靈敏準確，只需從羽毛、血液和胚胎中提取微量DNA樣品即可完成性別鑒定［4］.

近幾年，在哺乳動物早期胚胎性別鑒定過程中采用一種新的檢測方法即環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）［5-7］.該方法是2000 年由日本科學(xué)家Notomi［8］等發(fā)明的一種新的核酸擴增技術(shù).LAMP 法產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物可通過肉眼定性判斷反應(yīng)結(jié)果［9-12］，也可利用染料實施可視化檢測.該方法不需要瓊脂糖電泳和溴化乙錠染色，提高實驗的安全性［13］.因此，此法不僅實現(xiàn)恒溫條件下基因快速擴增，且具有操作簡單、快速高效、特異性強、靈敏度高、鑒定簡便等特點［13］.

目前，在禽類的早期性別鑒定中，至今還未出現(xiàn)關(guān)于應(yīng)用LAMP 法進行禽類早期性別鑒定的報道.因此，本研究以W染色體上假基因序列（EE 0.6序列）為模板，設(shè)計LAMP引物，通過對LAMP體系的建立和優(yōu)化，為建立可以在實際應(yīng)用中推廣的家雞及早期性別鑒定方法奠定基礎(chǔ)，也為家禽類性別鑒定的研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

雞血樣本采自安徽省滁州市全椒縣十字鎮(zhèn)周邊的養(yǎng)雞場.35只雌雞和45只雄雞，每個樣本在雞翅分別取1～2 mL靜脈血，用ACD抗凝存于4 ℃冰箱備用.

1.2 主要試劑

BstDNA 聚合酶購自NEB 公司；血液基因組DNA 提取試劑盒（DP318-02）及其常規(guī)分子試劑均購自天根生化科技（北京）有限公司，其余普通試劑購自上海國藥試劑公司.

1.3 引物設(shè)計與合成

圖1 特異性引物示意圖

登陸GenBank 網(wǎng)站查找家雞W 染色體上假基因EE0.6 序列（基因序列號：D85614），經(jīng)BLAST 比對，選取此基因高度保守序列作為模板序列，利用在線Primer ExplorerV3.0 軟件（http：//primerexplorer.jp/e/）設(shè)計 LAMP 內(nèi)外引物各一對，內(nèi)引物 FIP和BIP（FIP 由F2和FIc 組成，BIP 由 B2和B1c 組成）和外引物為F3和B3，在EE0.6基因片段上的位置見示意圖1.引物由南京金斯瑞公司合成，序列見表1.

表1 引物序列

1.4 全血基因組DNA的提取

用血液基因組DNA提取試劑盒提取家雞全血基因組DNA（DNA提取步驟按照說明書進行），超微量核酸蛋白測定儀測定基因組DNA濃度和純度，-20 ℃凍存.

1.5 LAMP反應(yīng)體系的構(gòu)建和優(yōu)化

參照相關(guān)文獻選取25 μL反應(yīng)體系：雌雄模板各1 μL，1.5 mmol dNTP，6 mmol MgCL2，10×反應(yīng)緩沖液2.5 μL，外引物F3/B3各0.2 μmol，內(nèi)引物FIP/BIP各1.6 μmol，BstDNA聚合酶8U，ddH2O補足至25 μL.95 ℃變性5 min；迅速取出反應(yīng)管放入冰盒中，加Bst DNA 聚合酶，混勻離心，反應(yīng)溫度設(shè)置為60 ℃，61 ℃，62 ℃，63 ℃，64 ℃，65 ℃，66 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)60 min；再加熱到80 ℃，5 min后終止反應(yīng)，擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定.確定最佳反應(yīng)溫度后，選擇LAMP恒溫反應(yīng)時間分別為45 min，60 min，90 min，120 min確定最佳反應(yīng)時間.同時對Mg2+濃度、dNTP濃度進行優(yōu)化.反應(yīng)管95 ℃加熱5 min 后，置于冰上冷卻，然后加入8U的Bst DNA 聚合酶，63 ℃恒溫反應(yīng)60 min，最后80 ℃，20 min 終止反應(yīng).反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定.

1.6 LAMP家雞性別鑒定準確性

選取DNA純度和濃度都較好的雌、雄家雞全血基因組DNA為模板，用最佳LAMP法反應(yīng)體系擴增的1 μL模板，擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定.

2 結(jié)果

2.1 LAMP反應(yīng)條件和體系的優(yōu)化

從圖2看出，溫度在60～66 ℃之間出現(xiàn)梯形條帶，經(jīng)過多次重復(fù)試驗，確定最佳反應(yīng)溫度為63 ℃.

圖2 反應(yīng)溫度的優(yōu)化

從圖3看出，反應(yīng)時間在30～60 min范圍內(nèi)得到擴增，經(jīng)多次重復(fù)試驗，確定最佳反應(yīng)時間為60 min.

圖3 反應(yīng)時間的優(yōu)化

從圖4看出，Mg2+濃度在4～6 mmol/L 之間出現(xiàn)梯形條帶，經(jīng)多次重復(fù)試驗，確定最佳Mg2+濃度為6 mmol/L.

圖4 Mg2+的優(yōu)化

2.2 LAMP法鑒定家雞性別的結(jié)果

LAMP法鑒定家雞性別時，雌性樣本都出現(xiàn)梯形條帶，而雄性和空白無任何條帶（結(jié)果如圖5），經(jīng)過多次重復(fù)試驗，雌雄擴增產(chǎn)物電泳時都出現(xiàn)相似的條帶.

3 討論

3.1 反應(yīng)體系中各個成分對LAMP法擴增的影響

LAMP的反應(yīng)體系需要進行不斷優(yōu)化，因為LAMP反應(yīng)在擴增的時候需要6個引物和酶的共同作用才進行反應(yīng)，缺一不可，對反應(yīng)體系中各成分濃度要求比較苛刻.引物序列是影響LAMP 反應(yīng)的特異性和產(chǎn)量的重要因素之一，所以在設(shè)計引物時，必須保證引物退火溫度在60～65 ℃之間，因為在這一溫度范圍內(nèi)BstDNA 聚合酶才達到最佳活性.另外，引物之間的濃度比也是影響LAMP 擴增的重要因素，B3、F3濃度過高抑制FIP、BIP結(jié)合到模板上，導(dǎo)致電泳時沒有梯度帶或者反應(yīng)不完全，參照相關(guān)文獻和優(yōu)化數(shù)據(jù)F3、B3與FIP、BIP濃度比最好是1/4～1/8左右.本研究結(jié)果表明，濃度比是1/8時結(jié)果較為理想.

圖5 家雞性別鑒定

Mg2+濃度過高或過低都會影響LAMP反應(yīng)，過高會降低反應(yīng)的特異性，過低會影響B(tài)stDNA聚合酶的活性.同時Mg2+與焦磷酸根離子反應(yīng)生成的焦磷酸鎂，是觀察反應(yīng)結(jié)果的參數(shù)之一.通過比較，本研究確定最適Mg2+濃度為6 mmol/L.

反應(yīng)溫度主要考慮兩個因素，一是引物Tm值，過高或過低都會影響引物與模板的結(jié)合.二是BstDNA聚合酶的最適溫度，反應(yīng)溫度太高或太低都會降低酶的活性甚至破壞酶的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致酶失活.但為提高反應(yīng)的特異性，一般在這兩個因素允許范圍內(nèi)選擇較高的溫度.經(jīng)過優(yōu)化，本研究確定退火溫度為63 ℃.

dNTPs是反應(yīng)的底物，加入過多不僅會造成浪費，還會降低反應(yīng)的特異性；而加入過少會降低反應(yīng)的敏感性.本研究參照相關(guān)文獻和優(yōu)化數(shù)據(jù)使用dNTP量是2.5 μL，即1.5 mmol/L.

3.2 鑒定結(jié)果分析

本實驗用LAMP法擴增雌雄家雞基因組DNA，擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳和肉眼直接觀察，結(jié)果顯示雌雞出現(xiàn)梯型條帶，肉眼觀察時雌性出現(xiàn)沉淀，雄性和空白無梯形條帶.在研究初期，在雌雄樣本中均會出現(xiàn)陽性結(jié)果，分析可能原因有：一、可能試劑遭到污染；二、雞可能是兼性雞，擁有三條染色體分別是ZZW；三、引物設(shè)計時選用靶序列并非雌性特異性.為確定造成實驗失敗的真正原因，首先將雄性樣本和一些可能遭到污染的試劑全部換掉，但擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳顯示雄性家雞仍然出現(xiàn)和雌性一樣的梯形條帶，據(jù)此可排除第一個原因.雙重PCR鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌性兩條帶，雄性只有一條帶.說明樣本本身性別無任何問題.經(jīng)逐一排除，最終確定引物出現(xiàn)了問題，由于引物未完全位于保守序列區(qū)，LAMP高靈敏度導(dǎo)致只要有部分堿基結(jié)合就可發(fā)生擴增，所以導(dǎo)致雌雄家雞出現(xiàn)了相同的梯形條帶.

經(jīng)過引物的重新設(shè)計及反應(yīng)條件不斷的摸索和優(yōu)化，最終實現(xiàn)利用LAMP 準確有效地鑒定家雞性別，準確率達到100%.與其他方法相比，LAMP具有很多優(yōu)越性：操作簡單，整個反應(yīng)在一個水浴鍋中即可完成，不需要昂貴、精密的儀器和設(shè)備且反應(yīng)結(jié)果可直接通過加核酸染料進行可視化分析；整個反應(yīng)時間縮短至1 h左右，省去傳統(tǒng)PCR的變性，退火，延伸的循環(huán)過程；特異性高，由于特異性引物是針對靶序列6個區(qū)域設(shè)計，其中任何一個區(qū)域與引物不匹配均不能進行核酸擴增；靈敏度高，比傳統(tǒng)PCR高出數(shù)量級的差異［14-15］，且隨著LAMP法的不斷完善，它將會有更廣泛的臨床和科研應(yīng)用前景.

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