胡雙發(fā)，彭彥，趙燕，劉峰，張學(xué)文*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125)

辣椒‘9704A’雄性不育特異基因hsf的克隆及表達(dá)分析

胡雙發(fā)1，彭彥1，趙燕1，劉峰2*，張學(xué)文1*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125)

對(duì)辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系‘9704A’和其同核保持系‘9704B’早期花蕾轉(zhuǎn)錄組的Solexa測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)1個(gè)差異性表達(dá)基因，其在不育系中的表達(dá)比在保持系中的表達(dá)高10倍，該基因與番茄、葡萄、擬南芥中的hsf基因同源性分別為87%、73%和70%，推測(cè)該基因?yàn)槔苯返膆sf基因。根據(jù)該基因序列設(shè)計(jì)引物，從辣椒‘9704A’中克隆該基因的全長(zhǎng)及核心cDNA序列，克隆到的hsf全長(zhǎng)與核心序列與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的序列一致，進(jìn)一步分析表明，該基因?qū)儆趆sf基因家族成員。用定量PCR分析hsf基因在‘9704A’和‘9704B’2種辣椒的根、莖、葉和晚期花蕾中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，該基因在不育系葉組織的表達(dá)量為其在保持系葉組織表達(dá)量的13.7倍，在不育系晚期花蕾中的表達(dá)量也為其在保持系晚期花蕾的3倍，而在2種辣椒系的莖中的表達(dá)量都很低，在2種辣椒系的根中的表達(dá)量均較高。

辣椒；雄性不育；熱激轉(zhuǎn)錄因子；定量分析

辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系‘9704A’是湖南省蔬菜研究所培育的一個(gè)不育性狀穩(wěn)定、在雜交育種中有良好應(yīng)用的辣椒不育品系[1]。何長(zhǎng)征等[2]從細(xì)胞水平對(duì)其進(jìn)行了研究，觀察到‘9704A’屬于孢子體敗育型，花粉母細(xì)胞不能完成減數(shù)分裂形成正常四分體。為從分子水平研究‘9704A’不育的機(jī)理，湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所采用Solexa高通量測(cè)序法，對(duì)辣椒不育系‘9704A’和其同核保持系‘9704B’早期花蕾總RNA進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(數(shù)據(jù)未發(fā)表)；陳遙等[3]根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從不育系中鑒定了一個(gè)差異表達(dá)的chs基因。本研究對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析，選擇表達(dá)差異顯著的另一基因進(jìn)行克隆，并分析該基因在辣椒不育系‘9704A’和保持系‘9704B’的根、莖、葉以及晚期花蕾中的表達(dá)情況，以進(jìn)一步探討辣椒雄性不育的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試?yán)苯?/p>

試驗(yàn)辣椒(Capsicum annuum L.)不育系‘9704A’和同核保持系‘9704B’為湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所培育的辣椒品系。材料種植于蛭石、黑土、沙子體積比為1∶1∶1的營(yíng)養(yǎng)缽中，置于白天24 ℃、夜晚18 ℃，每天光照時(shí)間為16 h的培養(yǎng)室中生長(zhǎng)。

1.1.2 菌 株

大腸桿菌(E.coli) DH5α為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑

Trizol試劑(Invitrogen公司)；RevertAidTMFirst Strand Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)；瓊脂糖凝膠回收試劑盒(維爾生物公司)；pMD18–T載體(Takara公司)；熒光定量試劑盒(Takara公司)；質(zhì)粒提取試劑盒(長(zhǎng)沙天根生物技術(shù)公司)；限制性內(nèi)切酶PstⅠ和SacⅠ(Fermentas公司)。

1.2 方 法

1.2.1 表達(dá)差異顯著基因生物信息學(xué)分析

利用 Stekel等[4]的 R統(tǒng)計(jì)值分析‘9704A’和‘9704B’中的表達(dá)差異基因，通過NCBI對(duì)表達(dá)差異顯著基因進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)分析。

1.2.2 辣椒RNA的提取

用Trizol試劑，按照其說明書分別提取‘9704A’和‘9704B’辣椒系的根、莖、葉及晚期花蕾的總RNA，并將提取好的RNA溶于DEPC處理過的水中，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。

1.2.3 表達(dá)差異顯著基因克隆

根據(jù)表達(dá)差異顯著基因序列，設(shè)計(jì)克隆核心區(qū)域和全長(zhǎng)基因的引物。擴(kuò)增全長(zhǎng)的引物為Up1 (5′–G AAGTCTAGAACCTTCCACCTA–3′)和Dn1(5′–AA ACAAGAAGGGGATTTTC–3′)。擴(kuò)增核心區(qū)域序列的引物為Up2(5′–GCTCTAGAATGATGAATAATA ATCCATTG–3′)和Dn2(5′–AACTGCAGACTAAGG GCTCGAATCC–3′)。PCR反應(yīng)總體系均為25 μL，其中‘9704A’ cDNA模板1 μL，10 μmol/L上、下游引物(Up1/Dn1或 Up2/Dn2)各 1 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，5 U/μL Taq酶0.25 μL，10×Buffer 2.5 μL，ddH2O 18.75 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min(全長(zhǎng)基因53 ℃退火)，72 ℃延伸90 s(全長(zhǎng)基因延伸150 s)，25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

擴(kuò)增的全長(zhǎng)和核心序列PCR產(chǎn)物分別經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化。將回收的兩段PCR擴(kuò)增片段克隆到pMD18–T，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布在含Amp(氨芐青霉素)LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆菌，經(jīng)LB液體培養(yǎng)基小量搖菌培養(yǎng)，常規(guī)提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切檢測(cè)。全長(zhǎng)序列和核心序列雙酶切體系一致，均為20 μL，其中質(zhì)粒模板13 μL，PstⅠ酶0.5 μL，SacⅠ酶0.5 μL，10×Buffer(Y) 2 μL，ddH2O 4 μL。將雙酶切檢測(cè)呈陽性質(zhì)粒送鉑尚生物公司測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果用NCBI的ORF finder、ExPASy網(wǎng)站、SignalP 4.1、DNAman進(jìn)行分析。

1.2.4 熒光定量RT–PCR檢測(cè)表達(dá)差異顯著基因

以辣椒不同組織的 cDNA為模板，辣椒 actin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)基因進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，以檢測(cè)辣椒hsf基因的表達(dá)情況。辣椒hsf基因熒光定量檢測(cè)引物為Up(5′–AGTGGTCGTACAACTGGTATTG–3′) 和Dn(5′–GCAAGATCCAAACGAAGAATGG–3′)。辣椒actin擴(kuò)增引物為actin–up (5′–GAAGCACCTCT CAACCCTAAG–3′)和actin–down (5′–GACCACTAG CATACAAGGAAAGA–3′)。定量PCR的反應(yīng)體系的配置及反應(yīng)程序設(shè)置均按照熒光定量試劑盒的說明進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)差異顯著基因同源性分析

利用 R統(tǒng)計(jì)值分析‘9704A’和‘9704B’中的Solexa測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)具有表達(dá)顯著的基因中，有一個(gè)基因在不育系‘9704A’中的表達(dá)量為保持系‘9704B’的10倍。結(jié)合BLAST分析表明，該表達(dá)差異顯著基因?qū)儆跓峒まD(zhuǎn)錄因子家族，與番茄 hsf(GenBank登錄號(hào) XM 004247151)、葡萄hsf(GenBank登錄號(hào)XM 002280582)和擬南芥hsf(GenBank登錄號(hào)NM 113182)的同源性分別為87%、73%和70%，因此，推測(cè)該基因?yàn)槔苯返膆sf基因。

2.2 hsf cDNA克隆與分析

用辣椒 hsf基因全長(zhǎng)及核心序列引物從辣椒‘9704A’中分別擴(kuò)增到2 000 bp左右的全長(zhǎng)cDNA片段和1 000 bp左右的核心cDNA片段。將全長(zhǎng)及核心片段進(jìn)行TA克隆及測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明克隆的辣椒hsf基因全長(zhǎng)及核心序列與‘9704A’轉(zhuǎn)錄組Solexa測(cè)序中的全長(zhǎng)和核心序列結(jié)果一致，說明該基因在Solexa測(cè)序中拼接獲得的全長(zhǎng)及核心序列是正確的。克隆得到的 hsf 基因(GenBank登錄號(hào) KC1638907)全長(zhǎng) cDNA為2 018 bp ，包含1個(gè)1 083 bp的核心序列開放閱讀框(ORF)、1個(gè)207 bp未正常剪切的內(nèi)含子序列、1個(gè)339 bp的5′UTR和1個(gè)389 bp 的3′UTR。

根據(jù)蛋白質(zhì)庫中登錄的Hsf序列，通過Mega軟件分析了該Hsf同源性關(guān)系(圖1)，結(jié)果顯示辣椒熱激轉(zhuǎn)錄因子在蛋白質(zhì)水平上與黃瓜(Cucumis sativus)XM_004146947.1的親緣關(guān)系最近，可分為1個(gè)分支。這一分支與毛果楊(Populus trichocarpa)、高粱(Setaria italic)及番茄(Solanum lycopersicum)中的Hsf聚成一類。

圖1 辣椒熱激轉(zhuǎn)錄因子(Hsf)氨基酸序列的同源性分析結(jié)果Fig.1 Phylogenetic analysis of amino acid sequence of Hsf protein

2.3 hsf基因在辣椒不同組織中的表達(dá)分析

熒光定量表達(dá)結(jié)果(圖2)顯示，在2種辣椒的莖中，hsf基因的表達(dá)水平都很低；在2種辣椒的根中， hsf基因的表達(dá)水平均較高。在2種辣椒葉組織中，hsf基因的表達(dá)存在顯著性差異，即在不育系‘9704A’的表達(dá)量是保持系‘9704B’的13.7倍。在2種辣椒的晚期花蕾中，hsf基因的表達(dá)也存在顯著性差異，在不育系中的表達(dá)量約為保持系的3倍。而Solexa測(cè)序結(jié)果中，hsf基因在不育系早期花蕾中的表達(dá)量為保持系的10倍，說明hsf基因隨著花蕾的發(fā)育，表達(dá)量也發(fā)生了顯著的變化。hsf基因在不育系葉和花蕾中的異常表達(dá)，推測(cè)hsf基因與辣椒雄性不育相關(guān)。

圖2 hsf在2種辣椒根、莖、葉和晚期花蕾組織中表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量RT–PCR分析Fig.2 The RT–PCR analysis of the hsf expression in root, stem, leaf and later flower bud in 9704A and 9704B

3 討 論

辣椒的雜種優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在增強(qiáng)長(zhǎng)勢(shì)、提高種子活力和抗病性等方面，而且雜交能改善果實(shí)品質(zhì)、增加產(chǎn)量。但在維持雜種優(yōu)勢(shì)的穩(wěn)定性方面，母本花粉授粉的自交會(huì)導(dǎo)致種子嚴(yán)重混雜，人工去雄是辣椒雜交制種的方式，但難以避免自交混雜。利用雄性不育系進(jìn)行雜交育種可以省去人工去雄的高額成本并阻斷其自交，因此，研究辣椒雄性不育機(jī)制對(duì)選育不育親本和雜交制種都有非常重要的意義。

目前分子生物學(xué)揭示的一些不育基因主要集中在線粒體中，已經(jīng)報(bào)道的辣椒線粒體不育相關(guān)基因有 atp6–706[5]、coxII–708[5]、orf168[6]、orf456–330[7]、orf507[8]等，但這些基因與‘9704A’的不育都沒有直接關(guān)聯(lián)，因此，‘9704A’的雄性不育可能有其獨(dú)特的機(jī)制。

熱激轉(zhuǎn)錄因子基因 hsf首先在酵母中被發(fā)現(xiàn)[9]，隨后在番茄[10]、果蠅[11]、哺乳動(dòng)物[12–13]以及擬南芥[14]、水稻[15]等模式作物中相繼發(fā)現(xiàn)了hsf基因。在酵母和果蠅中均只發(fā)現(xiàn)一個(gè)hsf，植物作為不可移動(dòng)生長(zhǎng)生物，在熱激響應(yīng)方面可能遠(yuǎn)比動(dòng)物中復(fù)雜，具有更大的hsf基因家族，在擬南芥、番茄、水稻等植物中分別鑒定出21、18和23個(gè)不等的hsf基因[16]。這表明植物熱激轉(zhuǎn)錄因子的多樣化能使植物更好適應(yīng)外界環(huán)境，也可能使其參與更多的遺傳現(xiàn)象，如CMS[17]。

植物中的光溫敏雄性不育現(xiàn)象間接證明雄性不育和熱脅迫之間存在著密切關(guān)系[18]。之后，陳建南等[19]將hsp70基因反義注入高粱，使可育花粉變成了不育；蘇晴等[20]發(fā)現(xiàn)hsp23.5基因在不育系小麥花藥不育產(chǎn)生的3個(gè)關(guān)鍵時(shí)期表達(dá)量存在顯著差異。這些研究表明hsp可參與不育性狀調(diào)控，但辣椒hsp基因與不育的相關(guān)性尚未見報(bào)道。

辣椒在受到高溫脅迫時(shí)，葉片作為主要響應(yīng)器官，在熱激轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)后，可以啟動(dòng)受該因子調(diào)控的相關(guān)基因表達(dá)。而熱激轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)的下游基因?yàn)闊峒さ鞍?Hsp)基因，這些蛋白多為小分子的分子伴侶，參與功能性蛋白的正確折疊和正常功能維護(hù)[21]。本試驗(yàn)中獲得的辣椒hsf基因不僅在‘9704A’不育系葉中高水平表達(dá)，且與保持系的差異非常明顯，而且在花中隨著花蕾的發(fā)育hsf基因的表達(dá)量也存在顯著差異。這些顯著差異表達(dá)，可能啟動(dòng)下游(如細(xì)胞器靶向)的Hsp的表達(dá)，這些Hsp又可能在細(xì)胞器如葉綠體和線粒體中發(fā)揮功能，從而關(guān)聯(lián)細(xì)胞質(zhì)決定的性狀CMS[22]。

[1] 鄒學(xué)校，侯喜林，劉榮云，等．辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因?qū)Σ挥导半s交一代農(nóng)藝性狀和生化特性的影響[J]．園藝學(xué)報(bào)，2004，31(6)：732–736．

[2] 何長(zhǎng)征，劉志敏，熊興耀，等．辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系9704A花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)觀察[J]．園藝學(xué)報(bào)，2008，35(4)：521–528．

[3] 陳遙，彭彥，劉峰，等．辣椒CHS基因表達(dá)的定量分析及與雄性不育的相關(guān)性[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，39(3)：259–264．

[4] Stekel D J，Git Y，F(xiàn)alciani F．The comparison of gene expression from multiple cDNA libraries[J]．Genome Research，2000，10(12)：2055–2061．

[5] 鄧明華，鄒學(xué)校，霍金龍，等．辣椒核質(zhì)互作雄性不育系線粒體不育基因coxII和atp6的克隆與序列分析[J]．西北植物學(xué)報(bào)，2010，30(10)：1935–1940．

[6] 鄧明華．辣椒胞質(zhì)雄性不育的分子生理機(jī)制及親緣關(guān)系研究[D]．長(zhǎng)沙：中南大學(xué)隆平分院，2011．

[7] 鄧明華，文錦芬，鄒學(xué)校，等．辣椒核質(zhì)互作雄性不育系9704A線粒體雄性不育基因片段分析[J]．園藝學(xué)報(bào)，2010，37(增刊)：2169．

[8] Deng M H，Wen J F，Huo J L，et al．Molecular characterization and prokaryotic expression of orf507 sterility-associated gene in chilli pepper cytoplasmic male sterility[J]．Pak J Bot，2012，44(5)：1497–1502.

[9] Wiederroeht G，Seto D，Parker C S．Isolation of the gene encoding the S. cerevisiae heat stress transcription factor[J]. Cell，1988，54(6)：841–853．

[10] Scharf K D，Rose S，Zott W，et al．Three tomato genes code for heat stress transcription factors with a region of remarkable homology to the DNA-binding domain of the yeast hsf[J]．EMBO J，1990，9 (13)：4495–4501．

[11] Clos J，Westwocd J T，Becker P B，et al．Molecular cloning and expression of a heaxameric drosophila heat stress factor subject to negative regulation[J]．Cell，1990，63(5)：1085–1097．

[12] Rabindran S K，Giorgi G，Clos J，et al．Molecular cloning and expression of a human heat stress factor[J]．Proc Natl Acad Sci，1991，88(16)：6906–6910．

[13] Sarge K D，Zimarino V，Holm K，et al．Cloning and characterization of two mouse heat stress factors with distinct inducible and constitutive DNA binding ability[J]．Genes Dev，1991，5(10)：1902–191l．

[14] Huhel A，Schottl F．Arabidopsis heat shock factor：Isolation and characterization of the gene and the recombinant protein[J]．Plant Mol Biol，1994，26(1)：353–362．

[15] Yamanouchi U，Yano M，Lin H，et al．A rice spotted leaf gene，Spl7，encodes a heat stress transcription factor protein[J]．Proc Natl Aead Sci，2002，99(11)：7530–7535．

[16] Nover L，Scharf K D，Cagliardi D，et al．The hsf world：Classification and properties of plant heat stress transcription factors[J]．Cell Stress Chaperones，1996，1(4)：215–223．

[17] Kotak S，Port M，Ganguli A，et al．Characterization of C-terminal domains of Arabidopsis heat stress transcription factors (hsfs) and identification of a new signature combination of plant class A hsfs with AHA and NES motifs essential for activator function and intracellular localization[J]．Plant J，2004，39(1)：98–112．

[18] 宋亞珍，陳天佑，雷國材，等．普通小麥PTS關(guān)溫敏雄性不育的遺傳分析[J]．西北農(nóng)林科技大學(xué)：自然科學(xué)版，2003，31(3)：47–50．

[19] 陳建南，傅鴻儀，路子顯，等．反義hsp70 反義RNA對(duì)高粱花粉的正常形成的影響[J]．科學(xué)通報(bào)，1997，42(18)：1994–1997．

[20] 蘇晴，茹振剛，秦志英，等．小熱激蛋白基因(hsp23.5)在小麥BNS雄性不育和轉(zhuǎn)換系差異表達(dá)[J]．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2013，21(1)：29–37．

[21] Pelham H R．A regulatory upstream promoter element in the Drosophila hsp70 heat-shock gene[J]．Cell，1982，30(2)：517–528．

[22] Liu F，Cui X，Horner H T，et al．Mitochondrial aldehyde dehydrogenase activity is required for male fertility in maize[J]．Plant Cell，2001，13(5)：1063–1078．

責(zé)任編輯：羅 維

英文編輯：羅 維

Cloning and expression analysis of a CMS specific hsf in Capsicum annuum L. ‘9704A’

HU Shuang-fa1，PENG Yan1，ZHAO Yan1，LIU Feng2*，ZHANG Xue-wen1 *
(1.College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Institute of Vegetables, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China)

Transcriptom Solexa sequencing was conducted on pepper early flower buds of the CMS line ‘9704A’ and its correspondence homonuclear maintainer line ‘9704B’ previously. A gene that expressed 10 times higher in pepper cytoplasm male sterile (CMS) line ‘9704A’ than it is in the maintainer line ‘9704B’ was identified. Gene homology analysis of the cloned hsf gene showed that the gene shares 87% homology with the hsf in Solanum lycopersicum, 73% in Vitis vinifera and 70% in Arabidopsis thaliana. According to the gene sequence we designed the primers and cloned the core sequence and hsf cDNA in pepper ‘9704A’. Sequence analysis showed that the cloned hsf cDNA was consistent with transcriptom Solexa sequencing. Gene analysis showed that the gene is one of the plants hsf gene family members. The real-time fluorescence quantitative RT-PCR primers were designed and the RT-PCR of the gene was carried out with the compared tissues in ‘9704A’ and ‘9704B’, using actin as reference gene. The result showed that the hsf gene expression in ‘9704A’ leaf is 13 times higher than it is in the maintainer line and in ‘9704A’ later flower bud is 3 times higher. The gene expressed very low in the stems of the two materials while high in the roots.

Capsicum annuum L.; male sterility; heat shock transcription factor; quantitative analysis

S641.3；Q781

A

1007?1032(2014)03?0257?05

10.13331/j.cnki.jhau.2014.03.007

投稿網(wǎng)址：http://www.hunau.net/qks

2014–01–07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31101425)

胡雙發(fā)(1988—)，男，湖南邵東人，碩士研究生，主要從事細(xì)胞分子遺傳研究，hushangfa@sina.com；?通信作者，liufengrich @126.com；xwzhang@hunau.edu.cn