郭玉層，潘俊鵬，哈小菲，方黎，方勇，米娜瓦爾·艾克拜爾

新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)廳哈密植物檢疫工作站，新疆哈密 839000

兩種瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌快速檢測(cè)技術(shù)的比較及應(yīng)用

郭玉層，潘俊鵬，哈小菲，方黎，方勇，米娜瓦爾·艾克拜爾

新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)廳哈密植物檢疫工作站，新疆哈密 839000

以瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌菌懸液田間和調(diào)運(yùn)檢疫抽樣檢查時(shí)采集的病組織為試材，比較免疫凝聚試紙條和瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的靈敏度和適應(yīng)性。兩者各有優(yōu)缺點(diǎn)，前者具有簡(jiǎn)便、快速、易操作特點(diǎn)，適用于田間快速檢測(cè)和診斷；后者靈敏度較高，特異性更好，需要較長(zhǎng)時(shí)間和儀器輔助，適用于室內(nèi)檢測(cè)。

瓜類(lèi)；細(xì)菌性果斑病菌；免疫凝聚試紙條；瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌核酸檢測(cè)試劑盒

瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病是西瓜和甜瓜上最重要的毀滅性種傳病害，其病原為嗜酸菌屬西瓜種（Acidovoraxavenaesubsp.citrulli,簡(jiǎn)稱(chēng)A.a.c），屬世界性檢疫病害，主要危害西瓜、甜瓜果實(shí)，產(chǎn)生大量病斑并造成果實(shí)腐爛，嚴(yán)重時(shí)有的地塊甚至100%發(fā)病，毀田絕收[1]。目前，使用抗病品種是防治果斑病最根本、最有效的措施，但是迄今并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)果斑病免疫或高抗的品種[2]。雖然化學(xué)藥劑處理可以減少種子的帶菌量,但不能從根本上起到防治細(xì)菌性果斑病的作用。因此快速而準(zhǔn)確地檢測(cè)病原物是有效進(jìn)行病害防治的基礎(chǔ)和前提。免疫凝聚試紙條檢測(cè)是利用抗原—抗體之間特異性結(jié)合原理的血清學(xué)技術(shù)[3]。瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌核酸檢測(cè)試劑盒（恒溫?cái)U(kuò)增-試紙法）將病原體DNA擴(kuò)增、核酸雜交和核酸試紙條檢測(cè)三種技術(shù)有機(jī)地融為一體，在反應(yīng)中加入西瓜細(xì)菌性果斑病菌特異性引物和特異性探針，一次性完成病原體的擴(kuò)增及雜交過(guò)程，然后用一次性核酸檢測(cè)裝置對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病菌感染進(jìn)行定性檢測(cè)。

本文探討西甜瓜細(xì)菌性果斑病菌快速檢測(cè)技術(shù)免疫凝聚試紙條法和瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌核酸檢測(cè)試劑盒（恒溫?cái)U(kuò)增-試紙法）在田間和調(diào)運(yùn)檢疫過(guò)程中的應(yīng)用及推廣。

1 材料與方法

1.1 供試材料

待檢病甜瓜采自哈密市淖毛湖鎮(zhèn)8批、大南湖鎮(zhèn)2批，在煙墩聯(lián)合檢疫檢查站隨機(jī)抽樣檢驗(yàn)的樣品28批，調(diào)自廣西、云南的西瓜各2批，調(diào)自鄯善縣的甜瓜2批，調(diào)自吐魯番的甜瓜1批，調(diào)自哈密市淖毛湖鎮(zhèn)的甜瓜4批，調(diào)自五家渠市的甜瓜4批，調(diào)自昌吉的西瓜3批。A.a.c菌株由新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心提供。

免疫檢測(cè)試紙條，瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌核酸檢測(cè)試劑盒（恒溫?cái)U(kuò)增-試紙條法）（以下簡(jiǎn)稱(chēng)核酸檢測(cè)試劑盒）。

1.2 病組織預(yù)處理及菌株的菌懸液配制

挑取供試菌株的單菌落，于KB培養(yǎng)基28℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3d，用無(wú)菌水配制成濃度約1× 108cfu/mL的菌懸液備用[4]。將田間采集和煙墩所抽樣品的西甜瓜病組織用酒精棉球進(jìn)行表面消毒，再用滅菌小刀切下，并分別一分為二，其中一份浸于免疫凝聚試紙條配套的樣品浸泡緩沖液袋中進(jìn)行充分的研磨待測(cè)，另一份用滅過(guò)菌的研缽分別磨碎，并加入適量核酸檢測(cè)試劑盒中提供的0.1×TE緩沖液（以能完全浸泡病組織為宜）浸泡備用。

2 檢測(cè)結(jié)果與分析

2.1 免疫凝聚試紙條檢測(cè)

用商品化A.a.c專(zhuān)化型免疫凝聚試紙條檢測(cè)將1.2中配制的A.a.c菌懸液和組織浸泡液。打開(kāi)試紙條包裝袋，取出試紙條，插入菌懸液和組織浸泡液中，浸泡深度不超過(guò)試紙條規(guī)定的示意線；5 min后取出試紙條，用吸水紙吸干并觀察。觀察陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，對(duì)照線和檢測(cè)線會(huì)在3～5min內(nèi)出現(xiàn)，表明檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；在觀察檢測(cè)無(wú)菌DDH2O和PBS緩沖液做的空白對(duì)照(陰性對(duì)照)時(shí)，免疫凝聚試紙條只出現(xiàn)一條對(duì)照線，表明檢測(cè)結(jié)果為陰性；在檢測(cè)瓜病組織浸泡液時(shí)，只出現(xiàn)對(duì)照線，沒(méi)有檢測(cè)線出現(xiàn)，表明檢測(cè)結(jié)果為陰性；這說(shuō)明檢疫人員采集的瓜樣品和抽樣檢驗(yàn)的瓜樣品中無(wú)瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病發(fā)生。如果沒(méi)有對(duì)照線出現(xiàn)，表明該試紙條檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。

2.2 瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)

將1.2中制備的A.a.c菌懸液和瓜病組織浸泡液按核酸檢測(cè)試劑盒中操作步驟進(jìn)行樣品處理及DNA的提取，恒溫?cái)U(kuò)增和檢測(cè)，并在規(guī)定時(shí)間內(nèi)判讀結(jié)果。利用核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)A.a.c菌懸液陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，質(zhì)控線和檢測(cè)線會(huì)在10min內(nèi)出現(xiàn)，表明檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；在檢測(cè)DDH2O水和緩沖液做的空白對(duì)照(陰性對(duì)照)中的試劑盒中試紙條只出現(xiàn)一條質(zhì)控線，表明檢測(cè)結(jié)果為陰性；在檢測(cè)瓜病組織浸泡液時(shí)，只出現(xiàn)質(zhì)控線，沒(méi)有檢測(cè)線出現(xiàn)，表明檢測(cè)結(jié)果為陰性；這說(shuō)明檢疫人員采集的瓜樣品和抽樣檢驗(yàn)的瓜樣品中無(wú)瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病發(fā)生或者瓜類(lèi)果斑病菌的細(xì)菌拷貝數(shù)低于試劑盒最低檢測(cè)限。若檢測(cè)線強(qiáng)度較弱時(shí)，將檢測(cè)線強(qiáng)度與色卡進(jìn)行對(duì)照：≧L4，為陽(yáng)性，＜L4為陰性。無(wú)紅色線條出現(xiàn)為無(wú)效，表明核酸試紙條失效或一次性核酸檢測(cè)裝置損壞。

2.3 兩種方法檢測(cè)效果的比較

免疫凝聚試紙條和核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)A.a. c菌懸液和西甜瓜病組織浸泡液各有特色和適應(yīng)性(表1)。

免疫凝聚試紙條檢測(cè)是利用抗原-抗體之間特異性結(jié)合原理的血清學(xué)技術(shù)，A.a.c菌株的蛋白質(zhì)作為抗原與試紙條中的特異性抗體結(jié)合，通過(guò)顯色反應(yīng)來(lái)表示菌懸液或病組織浸泡液的檢測(cè)結(jié)果，因此這種方法的特異性一般，靈敏度較低(106cfu/mL)，但投入成本低，操作簡(jiǎn)易，在田間地頭都可檢測(cè)，而且所用時(shí)間極短，只需5min左右，適合田間快速診斷病害[4]。

核酸檢測(cè)試劑盒是將病原體DNA擴(kuò)增、核酸雜交和核酸試紙條檢測(cè)三種技術(shù)有機(jī)地融為一體，在反應(yīng)中加入瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌特異性引物和特異性探針，一次性完成病原體的擴(kuò)增及雜交過(guò)程，然后用一次性核酸檢測(cè)裝置對(duì)瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌感染進(jìn)行定性檢測(cè)。因此這種方法的特異性較高，靈敏度較高(103～104cfu/mL)，投入成本也較高，且需少量的試劑和儀器設(shè)備才能完成檢測(cè)，其操作簡(jiǎn)單易行，單個(gè)樣品的檢測(cè)所需時(shí)間約2h，適合室內(nèi)快速檢測(cè)和相關(guān)研究使用。而且其中運(yùn)用了玻璃化DNA聚合酶保存技術(shù)實(shí)現(xiàn)了試劑盒的常溫運(yùn)輸，密閉的一次性核酸檢測(cè)裝置有效避免了擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠擴(kuò)散造成的污染和假陽(yáng)性。

表1 兩種方法檢測(cè)A.a.c的效果比較

3 小結(jié)與討論

本文將免疫凝聚試紙條和瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌核酸檢測(cè)試劑盒應(yīng)用于田間快速檢測(cè)和調(diào)運(yùn)檢疫快速檢測(cè)中，并將兩種檢測(cè)方法作了對(duì)比分析。結(jié)果表明，免疫凝聚試紙條檢測(cè)的靈敏度為106cfu/mL，并有簡(jiǎn)便、快速、易操作等特點(diǎn)，適合于田間病害快速檢測(cè)和診斷;瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌核酸檢測(cè)試劑盒應(yīng)的檢測(cè)靈敏度為103～104cfu/mL，比免疫凝聚試紙條提高了100～1000倍，效率高，特異性更好，但需要時(shí)間較長(zhǎng)2h，而且需要一定的儀器設(shè)備，適用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的室內(nèi)快速檢測(cè)。

免疫凝聚試紙條和瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌核酸檢測(cè)試劑盒的商業(yè)化及其推廣應(yīng)用，為瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病的田間快速檢測(cè)和病害早期的診斷和預(yù)防控制提供了技術(shù)條件，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，尤其是將兩項(xiàng)技術(shù)結(jié)合運(yùn)用于植物調(diào)運(yùn)檢疫的快速檢測(cè)，首先用免疫凝聚試紙條進(jìn)行瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌的快速檢測(cè)和初步篩選，檢出為陽(yáng)性后再用瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行確定，這樣大大提高了西、甜瓜的調(diào)運(yùn)檢疫效率和瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌的檢出率。

[1]周黎，張炳坤，冶海林，等.新疆瓜類(lèi)細(xì)菌性果腐病的發(fā)生與病原鑒定[J].蔬菜,2013（3）:64-67.

[2]閻莎莎，王鐵霖，趙廷昌.瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病研究進(jìn)展[J].植物檢疫，2011，25（3）:71-76.

[3]聞慧，劉興洋，李國(guó)英,等.甜瓜細(xì)菌性果斑病菌檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(20):6182-6185.

[4]馮建軍，許勇，李健強(qiáng),等.免疫凝聚試紙條和TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)西瓜細(xì)菌性果斑病菌比較研究[J].植物病理學(xué)報(bào),2006,36（2）:102-108.

郭玉層（1976年—），新疆阿勒泰人，農(nóng)藝師，主要從事植物檢疫的工作。

2013－12－08