張姿麗+蔣鋒（等）

摘要：選用穗位葉面積有顯著差異的超甜玉米（Zea mays L.）自交系T4和T19為親本配制雜交組合，以232個(gè)單株的F2群體為作圖群體，構(gòu)建了一張包含77個(gè)位點(diǎn)全長868.7 cM的玉米SSR標(biāo)記遺傳連鎖圖譜，標(biāo)記間的平均間距為11.28 cM。在F2群體中用復(fù)合區(qū)間作圖法在玉米全基因組上檢測穗位葉面積QTL，共檢測到4個(gè)與甜玉米穗位葉面積相關(guān)QTL，分別位于玉米第4、5、9染色體上，可解釋5.98%～11.12%的表型變異。這一結(jié)果將加快高產(chǎn)、耐密和抗倒伏甜玉米育種進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)玉米的分子標(biāo)記輔助選擇育種。

關(guān)鍵詞：甜玉米（Zea mays L.）；葉面積；復(fù)合區(qū)間作圖；QTL

中圖分類號：S513；Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）07-1502-04

QTL Mapping of Ear Leaf Area in Sweet Corn

ZHANG Zi-li，JIANG Feng，LIU Peng-fei，CHEN Qing-chun，ZHANG Yuan，WANG Xiao-ming

（Crop Research Institute， Zhongkai University of Agriculture and Engineering， Guangzhou 510225，China）

Abstract： Cross was made between two sweet corn inbreds（T19 and T4） significantly different in ELA（ear leaf area）. A genetic linkage map of 868.7 cM length was constructed with 77 SSR markers based on a sweet corn population consisting of 232 F2 individuals from the cross T4×T19， with an average interval length of 11.28 cM. 4 QTLs of ELA on chromosome 4， 5 and 9 were detected with composite interval mapping（CIM）. The phenotypic variance explained by each QTL was ranged from 5.98% to 11.12%. The QTL of ELA from this study may improve the breeding of high yield， density and realized lodging resistance and molecular marker-assisted selection（MAS of ELA）.

Key words：sweet corn（Zea mays L.）； ELA； composite interval mapping； QTL

高產(chǎn)是玉米（Zea mays L.）育種永恒追求的目標(biāo)，玉米的產(chǎn)量是由多個(gè)因素共同作用的結(jié)果，果穗產(chǎn)量性狀是其直接表現(xiàn)。葉片是玉米光合作用的主要器官，葉面積是決定光合產(chǎn)物的一個(gè)重要指標(biāo)[1] ，對于產(chǎn)量形成具有重要的作用。在作物育種上，葉面積作為一個(gè)重要的株型選擇指標(biāo)[2-6]。研究表明，玉米穗三葉面積與玉米單株產(chǎn)量呈顯著的正相關(guān)[7-11]，其中穗位葉面積與產(chǎn)量關(guān)系最為密切[4]。因此，研究玉米穗三葉面積，尤其是穗位葉面積的遺傳機(jī)制，對高效選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、廣適玉米新雜交種具有重要意義。

農(nóng)作物的葉面積是數(shù)量性狀，一般用QTL（Quantitative trait locus）定位的方法來研究其遺傳機(jī)制。在農(nóng)作物葉面積QTL 定位方面，水稻上研究比較多，尤其是對水稻劍葉形狀和大小進(jìn)行了大量的QTL 定位工作[12，13]。而在玉米葉面積QTL的研究中，穗位葉面積相關(guān)的報(bào)道比較少[14，15]。Agrama等[14]對不同氮水平下玉米穗位葉面積進(jìn)行了QTL定位，在高氮水平下定位到了3個(gè)和穗位葉面積相關(guān)的QTL，分別位于第5、8、10染色體上；在氮脅迫條件下定位到4個(gè)和穗位葉面積相關(guān)的QTL，分別位于第1、3、8、8染色體上。劉建超等[15]利用218個(gè)F8的重組自交系為作圖群體，對玉米葉面積（穗三葉面積）進(jìn)行了QTL 定位分析，兩年共定位到7個(gè)和葉面積相關(guān)的QTL 位點(diǎn)。

本研究以葉面積差異顯著的超甜玉米自交系T19和T4為親本配制的F2群體為作圖群體，用復(fù)合區(qū)間作圖法在全基因組上檢測了穗位葉面積相關(guān)QTL，分析了其遺傳基礎(chǔ)， 為玉米葉面積的遺傳改良及分子標(biāo)記輔助選擇奠定基礎(chǔ)，為加快高產(chǎn)、耐密和抗倒伏甜玉米育種進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)玉米的分子標(biāo)記輔助選擇育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試親本T4和T19是由仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)學(xué)院玉米研究組經(jīng)多年嚴(yán)格自交選育的甜玉米自交系。經(jīng)多年田間調(diào)查，自交系T19的平均穗位葉面積為447.27 cm2，T4為673.56 cm2，兩親本穗位葉面積差異極顯著（P<0.01）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間試驗(yàn)方法 2009年上半年，在仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院鐘村教學(xué)農(nóng)場選取土壤肥力均勻一致的田塊，以T4（P1）和T19（P2）為親本雜交。2009年下半年，將產(chǎn)生的F1自交獲得F2群體。2010年上半年，種植該組合P1、P2、F1和F2材料，嚴(yán)格控制行距和株距，四周設(shè)置保護(hù)行；同時(shí)采用Paterson等[16]的方法提取該組合親本、F1和F2群體的基因組DNA，于成株期調(diào)查各F2單株穗位葉面積，用以檢測葉面積QTL。

1.2.2 SSR標(biāo)記分析及連鎖圖譜構(gòu)建 根據(jù)Wang等[17]的玉米高多態(tài)性SSR引物及已發(fā)表的玉米連鎖遺傳圖譜設(shè)計(jì)引物，檢測T4和T19基因組之間的多態(tài)性，以F2為作圖群體構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。SSR引物由上海Sangon公司合成，參照Zhang等[18]的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物電泳和銀染。用JoinMap 3.0軟件分析標(biāo)記間的連鎖關(guān)系，構(gòu)建分子遺傳圖譜[19]，圖距單位為cM（centi-Morgan）。

1.2.3 QTL分析及命名 性狀平均值、標(biāo)準(zhǔn)差等采用Microsoft Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Windows QTL CartograpHer 2.5結(jié)合復(fù)合區(qū)間作圖法在F2群體中檢測穗位葉面積QTL[20]。通過1 000次隨機(jī)抽樣確定對數(shù)優(yōu)勢比（LOD）閾值，連鎖的最低LOD為2.5，最大遺傳距離為50 cM。

QTL命名方法參照Mccouch等[21]的方法，按照QTL+性狀+QTL序號，其中QTL以小寫“q”開始，性狀以英文縮寫表示，如穗位葉面積以ELA（Ear leaf area）表示，后加數(shù)字“1”、“2”、“3”等加以區(qū)別。

2 結(jié)果與分析

2.1 穗位葉面積正態(tài)分布檢驗(yàn)結(jié)果

對F2單株材料穗位葉面積進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，葉面積統(tǒng)計(jì)量見表1。從變幅和變異系數(shù)看，群體穗位葉面積性狀的變異較大；從偏度和峰值看，葉面積未顯著偏離正態(tài)分布，符合QTL定位的基本要求，可以進(jìn)行QTL檢測。

2.2 標(biāo)記連鎖圖譜構(gòu)建

從250對SSR引物中篩選出在T4和T19之間有多態(tài)性的引物81對，用JoinMap 3.0軟件對多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行連鎖關(guān)系分析，得到一張含77個(gè)位點(diǎn)全長868.7 cM的玉米SSR標(biāo)記遺傳連鎖圖譜，標(biāo)記間的平均間距為11.28 cM（圖1）。

2.3 甜玉米穗位葉面積QTL定位

將232個(gè)F2單株穗位葉面積數(shù)據(jù)結(jié)合分子標(biāo)記連鎖圖譜信息，1 000次抽樣確定LOD閾值，應(yīng)用復(fù)合區(qū)間作圖的方法檢測到4個(gè)QTL，分別位于第4、5、9染色體上（圖1，表2）。其中，qELA-1和qELA-4分別位于第4、9染色體上，加性效應(yīng)值分別為-22.05和-31.81，可分別解釋7.18%和11.12%的表型變異；在第5染色體上檢測到2個(gè)QTL（qELA-2和qELA-3），加性效應(yīng)值分別為-24.08和-23.74，對表型變異的貢獻(xiàn)率分別為5.98%和7.01%。

3 小結(jié)與討論

農(nóng)作物的株高、葉面積以及產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀屬于數(shù)量性狀，自20世紀(jì)80年代以來，分子標(biāo)記技術(shù)以及QTL定位方法的快速發(fā)展為復(fù)雜數(shù)量性狀的研究提供了強(qiáng)有力的手段。隨著分子遺傳學(xué)的迅猛發(fā)展，國內(nèi)外已經(jīng)構(gòu)建了不少主要農(nóng)作物（水稻、玉米、小麥）的分子標(biāo)記連鎖圖譜，為農(nóng)藝性狀的QTL定位和遺傳分析打下了基礎(chǔ)。葉面積是構(gòu)成玉米理想株型的重要農(nóng)藝性狀，與玉米產(chǎn)量、耐密性、抗倒伏性及生態(tài)適應(yīng)性密切相關(guān)。目前玉米生產(chǎn)中的雜交種葉片總數(shù)約在20片左右，在所有葉片中，穗位葉及其上下兩葉（合稱穗三葉）的光合作用強(qiáng)，對產(chǎn)量的貢獻(xiàn)較大。

Agrama等[14]對不同氮水平下玉米穗位葉面積進(jìn)行了QTL定位，在高氮水平下定位到了3個(gè)和穗位葉面積相關(guān)的QTL，分別位于第5、8、10染色體上；在氮脅迫條件下定位到4個(gè)和穗位葉面積相關(guān)的QTL，分別位于第1、3、8、8染色體上。與本試驗(yàn)結(jié)果比較，并沒有發(fā)現(xiàn)與之染色體共位的QTL。說明不同定位群體對于QTL檢測影響非常大。此外，由于環(huán)境與基因型的互作，同一性狀不僅在不同的定位群體中表現(xiàn)不一致，在同一群體的不同種植方式、不同的地理位置或者不同的年份間的表現(xiàn)也往往不一致。

本研究利用2個(gè)葉面積有顯著差異的超甜玉米自交系為親本配制組合，在F2單株中檢測到4個(gè)穗位葉面積QTL，分別位于第4、5、9染色體上。其中，qELA-4位于第9染色體，與劉建超等[15]在第9染色體定位到的QTL可以在兩年同時(shí)檢測到的結(jié)論一致。因此可以推測在第9染色體上存在穩(wěn)定可靠的葉面積QTL，并且其在第9染色體上的貢獻(xiàn)率占11.12%，證明第9染色體在控制葉面積上有著比較重要的作用。此定位結(jié)果有助于驗(yàn)證和豐富前人的研究結(jié)果，并可作為玉米葉面積相關(guān)QTG（Quantitative trait gene）的候選基因。在不同品種之間，用穗位葉的莖葉夾角、穗位葉長和葉形可粗略預(yù)測果穗和穗軸直徑的大小及穗行數(shù)的多少。研究這些對應(yīng)關(guān)系將有助于育種工作的開展及產(chǎn)量預(yù)測，至于是否可定量預(yù)測穗部其他性狀特征還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 薛珠政，盧和頂，林建新.群體結(jié)構(gòu)對玉米冠層特征、光合特性及產(chǎn)量的影響[J].雜糧作物，1998，18（6）：27-29.

[2] 趙久然.超級玉米指標(biāo)及選育模式[J].玉米科學(xué)，2005，13（1）：3-4，9.

[3] 胡昌浩，董樹亭，岳壽松，等.玉米栽培生理[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1995.

[4] 呂川根，鄒江石.兩個(gè)超級雜交稻與汕優(yōu)63光合株型的比較分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36（6）：633-639.

[5] 趙久然，孫世賢.對超級玉米育種目標(biāo)及技術(shù)路線的再思考[J].玉米科學(xué)，2007，15（1）：21-23，28.

[6] 楊 松，陳 強(qiáng)，劉俊林，等.超噸糧田中玉米植株形狀與穗粒重的關(guān)系[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1994，9（3）：112-116.

[7] 白永新，王早榮，鐘改榮，等.玉米高配合力親本自交系、雜交種棒三葉的性狀分析及葉面積的相關(guān)性研究[J].玉米科學(xué)，1999， 7（2）：24-26.

[8] 白永新，王早榮，陳寶國，等.玉米雜交種棒三葉特征及其葉面積與單株穗重、粒重的相關(guān)性研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2000，15（2）：32-35.

[9] 陳永欣，翟廣謙，李 彥，等.糯玉米自交系、雜交種棒三葉與產(chǎn)量之間相關(guān)性分析[J].玉米科學(xué)，2001，9（2）：50-52.

[10] 陳范駿，米國華，張福鎖.玉米氮高效組合雜種優(yōu)勢分析[J].玉米科學(xué)，2006，14（4）：125-128.

[11] LAFITTE H R， EDMEADES G O.Improvement for tolerance to low soil nitrogen in tropical maize. II. Grain yield，biomass production，and N accumulation[J]. Field Crops Res，1994，39（1）：15-25.

[12] CAO G Q， GAO Y M， ZHU J. QTL analysis for flag leaf length in a rice DH population under multi environments[J]. Acta Agron Sin，2007，33（2）：223-229.

[13] 羅 偉，胡 江，孫 川，等.水稻抽穗期功能葉葉型相關(guān)性狀遺傳分析[J].分子植物育種，2008，6（5）：853-860.

[14] AGRAMA H A S， ZAKARIA A G， SAID F B，et al.Identification of quantitative trait loci for nitrogen use efficiency in maize[J].Mol Breed，1999，5（2）：187-195.

[15] 劉建超，褚 群，蔡紅光，等.玉米SSR連鎖圖譜構(gòu)建及葉面積的QTL定位[J].遺傳，2010，32（6）：625-631.

[16] PATERSON A H， BRUBAKER C L， WENDEL J F. A rapid method for extraction of cotton （Gossypium spp.） genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis[J]. Plant Mol Biol Rep，1993，11：122-127.

[17] WANG F G， ZHAO J R， DAI J R， et al.Selection and development of representative simple sequence repeat primers and multiplex SSR sets for high throughput automated genotyping in maize[J].Chinese Sci Bull，2007，52（2）：215-223.

[18] ZHANG J， GUO W Z， ZHANG T Z. Molecular linkage map of allotetraploid cotton （Gossypium hirsutum L.×Gossypium barbadense L.）with a haploid population[J]. Theor Appl Genet，2002，105：1166-1174.

[19] VAN O J， VOORRIPS R E. JoinMap？誖version 3.0： Software for the calculation of genetic linkage maps[R].Wangeningen， the Netherlands：Plant Research International，2001.

[20] BASTEN C J， WEIR B S， ZENG Z B. QTL CartograpHer version 2.0[R].Raleigh， NC： Department of Statistics， North Carolina State University，2001.

[21] MCCOUCH S R， CHO Y G， YANO P E， et al. Report on QTL nomenclature[J]. Rice Genet Newslett，1997，14：11-13.

[9] 陳永欣，翟廣謙，李 彥，等.糯玉米自交系、雜交種棒三葉與產(chǎn)量之間相關(guān)性分析[J].玉米科學(xué)，2001，9（2）：50-52.

[10] 陳范駿，米國華，張福鎖.玉米氮高效組合雜種優(yōu)勢分析[J].玉米科學(xué)，2006，14（4）：125-128.

[11] LAFITTE H R， EDMEADES G O.Improvement for tolerance to low soil nitrogen in tropical maize. II. Grain yield，biomass production，and N accumulation[J]. Field Crops Res，1994，39（1）：15-25.

[12] CAO G Q， GAO Y M， ZHU J. QTL analysis for flag leaf length in a rice DH population under multi environments[J]. Acta Agron Sin，2007，33（2）：223-229.

[13] 羅 偉，胡 江，孫 川，等.水稻抽穗期功能葉葉型相關(guān)性狀遺傳分析[J].分子植物育種，2008，6（5）：853-860.

[14] AGRAMA H A S， ZAKARIA A G， SAID F B，et al.Identification of quantitative trait loci for nitrogen use efficiency in maize[J].Mol Breed，1999，5（2）：187-195.

[15] 劉建超，褚 群，蔡紅光，等.玉米SSR連鎖圖譜構(gòu)建及葉面積的QTL定位[J].遺傳，2010，32（6）：625-631.

[16] PATERSON A H， BRUBAKER C L， WENDEL J F. A rapid method for extraction of cotton （Gossypium spp.） genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis[J]. Plant Mol Biol Rep，1993，11：122-127.

[17] WANG F G， ZHAO J R， DAI J R， et al.Selection and development of representative simple sequence repeat primers and multiplex SSR sets for high throughput automated genotyping in maize[J].Chinese Sci Bull，2007，52（2）：215-223.

[18] ZHANG J， GUO W Z， ZHANG T Z. Molecular linkage map of allotetraploid cotton （Gossypium hirsutum L.×Gossypium barbadense L.）with a haploid population[J]. Theor Appl Genet，2002，105：1166-1174.

[19] VAN O J， VOORRIPS R E. JoinMap？誖version 3.0： Software for the calculation of genetic linkage maps[R].Wangeningen， the Netherlands：Plant Research International，2001.

[20] BASTEN C J， WEIR B S， ZENG Z B. QTL CartograpHer version 2.0[R].Raleigh， NC： Department of Statistics， North Carolina State University，2001.

[21] MCCOUCH S R， CHO Y G， YANO P E， et al. Report on QTL nomenclature[J]. Rice Genet Newslett，1997，14：11-13.

[9] 陳永欣，翟廣謙，李 彥，等.糯玉米自交系、雜交種棒三葉與產(chǎn)量之間相關(guān)性分析[J].玉米科學(xué)，2001，9（2）：50-52.

[10] 陳范駿，米國華，張福鎖.玉米氮高效組合雜種優(yōu)勢分析[J].玉米科學(xué)，2006，14（4）：125-128.

[11] LAFITTE H R， EDMEADES G O.Improvement for tolerance to low soil nitrogen in tropical maize. II. Grain yield，biomass production，and N accumulation[J]. Field Crops Res，1994，39（1）：15-25.

[12] CAO G Q， GAO Y M， ZHU J. QTL analysis for flag leaf length in a rice DH population under multi environments[J]. Acta Agron Sin，2007，33（2）：223-229.

[13] 羅 偉，胡 江，孫 川，等.水稻抽穗期功能葉葉型相關(guān)性狀遺傳分析[J].分子植物育種，2008，6（5）：853-860.

[14] AGRAMA H A S， ZAKARIA A G， SAID F B，et al.Identification of quantitative trait loci for nitrogen use efficiency in maize[J].Mol Breed，1999，5（2）：187-195.

[15] 劉建超，褚 群，蔡紅光，等.玉米SSR連鎖圖譜構(gòu)建及葉面積的QTL定位[J].遺傳，2010，32（6）：625-631.

[16] PATERSON A H， BRUBAKER C L， WENDEL J F. A rapid method for extraction of cotton （Gossypium spp.） genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis[J]. Plant Mol Biol Rep，1993，11：122-127.

[17] WANG F G， ZHAO J R， DAI J R， et al.Selection and development of representative simple sequence repeat primers and multiplex SSR sets for high throughput automated genotyping in maize[J].Chinese Sci Bull，2007，52（2）：215-223.

[18] ZHANG J， GUO W Z， ZHANG T Z. Molecular linkage map of allotetraploid cotton （Gossypium hirsutum L.×Gossypium barbadense L.）with a haploid population[J]. Theor Appl Genet，2002，105：1166-1174.

[19] VAN O J， VOORRIPS R E. JoinMap？誖version 3.0： Software for the calculation of genetic linkage maps[R].Wangeningen， the Netherlands：Plant Research International，2001.

[20] BASTEN C J， WEIR B S， ZENG Z B. QTL CartograpHer version 2.0[R].Raleigh， NC： Department of Statistics， North Carolina State University，2001.

[21] MCCOUCH S R， CHO Y G， YANO P E， et al. Report on QTL nomenclature[J]. Rice Genet Newslett，1997，14：11-13.